小干涉RNA(siRNA):是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA,由约20个碱基对组成,包括5个磷酸盐,2个核苷和3个悬臂。 RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具,通过这种方式,利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉默,迅速阻断基因活性。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用,是对特定信使RNA(mRNA …
阅读更多 »Western Blot化学发光(ECL)淬灭的原因?
做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生,经常有朋友反映,加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光,可亮光很快就消逝了,压完片后,条带却很弱,甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么? 要解释这种情况发生的原因,必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化,产生荧光 …
阅读更多 »动物实验系列篇章之四——实验动物的除毛、给药方法
一、实验动物的除毛 在动物实验中,被毛有时会影响实验操作与观察,因此必须除去。除去被毛的方法有剪毛、拔毛、剃毛和脱毛等。 (一)剪毛法:剪毛法是将动物固定后,先用蘸有水的纱布把被毛浸湿,再用剪毛剪刀紧贴皮肤剪去被毛。不可用手提起被毛,以免剪破皮肤。剪下的毛应集中放在一容器内,防止到处飞扬。给狗、羊等动物采血或新生乳牛放血制备血清常用此法。 (二)拔毛法:拔毛 …
阅读更多 »动物实验系列篇章之六——实验动物各种体液、骨髓的采集方法
一、消化液的采集 (一) 唾液 1. 直接抽取法 在急性实验中, 可用吸管直接插入动物口腔或唾液腺导管抽吸唾液,此法非常简单,但从口腔抽吸唾液会有杂质混入。 2. 制造腮腺瘘法 在慢性实验中,收集狗的唾液,要用外科手术方法将腮腺导管开口移向体外,即以腮腺导管为中心,切成一直径约2~3cm的圆形粘膜片,将此粘膜片,与周围组织分开,穿过皮肤切口引到颊外,将带有导 …
阅读更多 »成功转染siRNA的主要关键点有什么?
1.设计合成有效的siRNA RNAi的核心需要siRNA对相应mRNA进行有效的结合和作用。siRNA的设计合成首先很重要,最优的设计可以用最小的工作浓度取得满意的沉默效果,减少副反应的发生。siRNA的设计可以通过检索,优先选用经过验证的siRNA或设计多对siRNA。需要强调的是,需要同时设置阴性对照以排除非特异沉默现象和阳性对照以确认整个实验体系的有 …
阅读更多 »动物实验系列篇章之一——实验动物的抓取和固定
在进行实验时,为了不损伤动物的健康,不影响观察指标,并防止被动物咬伤,首先要限制动物的活动,使动物处于安静状态,工作人员必须掌握合理的抓取固定方法。抓取动物前,必须对各种动物的一般习性有所了解。操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴,不能恐吓动物,同时,要爱惜动物,使动物少受痛苦。 一、小鼠 小鼠性情较温顺,一般不会咬人,比较容易抓取固定。通常用右手 …
阅读更多 »病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中,对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤:1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起 …
阅读更多 »siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好?
1.siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好? siRNA的沉默效果是有时效性的,在最佳的时间点观察,会得到更加明显的沉默效果,这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定,因为一个是消耗mRNA,一个是产生mRNA。对转染siRNA,在核酸水平,转染后8-48小时,即可观察到mRNA水平的逐步下降,一般来说,转染后48小时进行qRT-PCR …
阅读更多 »动物体内转染需要哪些条件?
1.每次动物实验,需要准备什么东西,器材? ①转染的核酸,如siRNA,miRNA,mimic、inhibitor,也可以转染DNA。 ②转染试剂和动物。 ③进行注射的器材。 2.可以转染的核酸都有什么?细胞实验的核酸可以用吗? 可以转染小片断RNA如siRNA,miRNA,mimic、inhibitor,也可以转染DNA。进行体外细胞实验的核酸就可以。但要 …
阅读更多 »PCR实验最常见的9个问题及解决方案
1. 如何有效设计引物 (1)使用Oligo或Primer设计引物,在保守区内设计,长度一般在18-27bp,上下游引物Tm值最好是60-75℃,GC含量=40%-60%,引物自身及引物之间不应存在互补序列,避免发夹结构。 2. PCR电泳无扩增条带 (1)酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的 …
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