英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
体外培养细胞传代规范的建立 细胞从原代培养时开始，就要建立细胞传代常规，即最好依据严格的时间表进行传代等操作，这样可以保持和监控细胞的增殖行为。若到了适合的时间，细胞还没有达到足够高的密度（即细胞没有彼此汇合），那么应增加接种密度：相反，若细胞很快彼此汇合，则应降低接种密度。理想的细胞浓度是使细胞每3~4d 更换培养液，每7d 传代。常规传代使细胞可重复标准 …
阅读更多 »DEAE－葡聚糖介导的转染：提高细胞活力的方案
与之前文章中介绍的DEAE－葡聚糖方法相反，此替方案采用较低浓度的DEAE－葡聚糖( 250μg/mL) ，与细胞作用的时间较长（达8h) 。尽管不如使用高浓度DEAE－葡聚糖的转染效率高，但低水平的DEAE－葡聚糖细胞毒性小。 试剂 DMEM 培养基 HEPES 缓冲的DMEM 培养基 方法 转染前24h, 通过胰酶消化收集指数生长的细胞，按105 个细胞 …
阅读更多 »为什么脂质体细胞转染试剂会造成细胞毒性？
已有众多的文献报道，脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC（蛋白激酶C）通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30)；如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777 …
阅读更多 »怎样提高悬浮细胞的siRNA转染效率？
悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染，其和贴壁细胞转染还是有很大不同的。 目前大多数实验室用的是脂质体类的转染试剂，脂质体转染是基于电荷吸引原理，先形成 …
阅读更多 »藻类细胞电转效率特别低有什么解决方案
对于藻类细胞电转效率特别低的问题，主要考虑以下。 质粒纯度和浓度： 如果质粒 DNA 的纯度不够，或者有蛋白质、RNA、内毒素等污染，可能会影响电转效率。建议确保质粒通过高质量的提取试剂盒提取，且 OD260/OD280 比率应在 1.8-2.0 之间。 质粒浓度过高或过低都可能影响转化率，建议对质粒浓度进行优化，一般而言，20-50 ng/μL 的浓度是比 …
阅读更多 »siRNA转染效率不理想的原因有哪些？
siRNA转染效率不理想，常见的原因有： 1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率 …
阅读更多 »细胞RNA转染的几点建议
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »siRNA细胞转染效率低下的原因
1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这 …
阅读更多 »电转染实验时，DNA有什么要求？
使用Entranster-E电转染试剂进行电转染实验时，应使用高纯度、无菌和无污染的DNA进行电穿孔实验。质粒DNA要求无内毒素，OD值为1.8-2.0。不建议使用微型试剂盒制备DNA，因为它可能含有高水平的内毒素。 不要使用仅用乙醇沉淀法纯化的DNA …
阅读更多 »细胞污染的心得体会
细胞培养的质量好坏是细胞相关实验的基石，许多朋友都曾经历过因为细胞污染影响实验进度的郁闷，被老板批评是小事，要是影响到正常毕业就是大事了。怎么分辨细胞污染，是不是细胞污染？是那种细胞污染？细胞污染后如何处理？ 预防污染 细胞培养是个细致活儿，一不小心就会造成污染，最好养成良好无菌操作习惯。个人经验是，进实验室之前最好洗手，很多实验者都不bother，这是国人 …
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