蛋白和酶

做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生，经常有朋友反映，加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光，可亮光很快就消逝了，压完片后，条带却很弱，甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么？ 要解释这种情况发生的原因，必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光 …

大多数蛋白质凝胶电泳是还原性条件下的十二烧基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE) 。 ＊样品准备 还原试剂2－巯基乙醇或者二硫苏糖醇加在变性胶的样品缓冲液中，还原蛋白质中的二硫键，确保蛋白质维持在测定分子量所需的无规则卷曲状态。 样品缓冲液分成小管，贮于－20℃ 。甘油浓度很高，足以防止样品冻结，所以不必担心冻融所造成的损伤。当管中没有还原试剂的味 …

       我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存 …

做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现，要弄清楚“背景太高”的原因，先要知道“背景”是什么，“背景”也是发光，影响发光的因素就会影响背景。     影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的，抗体浓度过高，洗涤不充 …

离心方法主要有两种：制备型（用来分离某些颗粒）和分析型（用来了解分离颗粒的物理性质）。 分子或细胞生物学实验室中所作的决大多数离心机属于制备型离心机，而多数常规制备型离心是差速离心。 g 力和每分钟旋转次数(rpm) 是大略的值：取决于所用的离心机型号和转子。 差速离心（沉淀） 原理：样品在一定速度下离心，分成上清部分与沉淀部分。样品根据沉降速度不同得到分离 …

特异性差，出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20 …

一、DNA 聚合酶 分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板，但也可拷贝RNA ，尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I （全酶）、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段）、T4 …

材料 SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞系（药物标记的非分泌型； ATCC) 添加10mmol/L HEPES 和1mmol/L 丙酮酸钠的DMEM- 10 和DMEM-20 完全焙养基 免疫的实验动物：小鼠、大鼠或仓鼠（在初次接种后10~14d 备用) 50% （m/V) PEG 溶液，无菌 DMEM 完全培养基，未添加血清 氯化铵溶液： 0. 02mol/ …

限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列之内或其附近的特异位点上，井在此切割双链DNA 。它可分3 类，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 I 类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP 的限制（切割）活性。Ⅲ类限制酶在识别位点上切割DNA ，然后从底物上解离。 …

1.       样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2.       凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的 …