2025年 2 月 19日, 星期三
新闻

蛋白和酶

常用的蛋白水解酶抑制剂

当细胞被裂解,内容物释放时,蛋白水解酶和其他一些降解的酶也一同被释放,这时候需要在裂解的缓冲液中加入蛋白水解酶。PS: 细胞自己的蛋白水解酶也会降解细胞内的蛋白质。 抑制剂 靶向的蛋白酶 有效浓度 储存浓度 其他 抑蛋白酶肽 丝氨酸蛋白水解酶 0.1-2ug/ml 10mg/ml溶解在PBS中 避免反复冻融 EDTA 金属蛋白水解酶 0.5-2mmol/L …

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western-blot化学发光(ECL)出现高背景是什么原因?

做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现,要弄清楚“背景太高”的原因,先要知道“背景”是什么,“背景”也是发光,影响发光的因素就会影响背景。     影响发光的因素主要有:1.含HRP的抗体;2.发光试剂;3.和发光试剂反应的杂质,如含杂质的膜。这里面,在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的,抗体浓度过高,洗涤不充 …

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western-blot化学发光时,出现非特异条带,该怎么办?

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面: 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体,或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体,或降低抗体浓度,缩短抗体孵育时间,优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量,延长洗膜时间,或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …

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Western blot 中Tween-20的作用是什么?应该怎么用?

Western blot的洗液TBST是实验室常用的配制液体,对于TBST的配方也基本上相残不多,其中配方中就有一种组分是Tween-20,一种黄色或琥珀色澄明的油状液体,具有特殊的臭气和微弱苦味。用移液枪吸取时会有一种滞后感。为什么在Western blot的洗液TBST中要加入这么一种试剂,Tween-20在Western blot 中在发挥什么样的作用 …

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单克隆抗体制备中的免疫接种

材料靶抗原: 表达于细胞的抗原,或蛋白质、多肽生理盐水无血清培养基:仅用于细胞接种弗氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant, CFA)实验动物: 无病原体大鼠、小鼠或仓鼠弗氏不完全佐剂(incomplete Freunds adjuvant, IFA)1~2ml玻璃注射器(有Luer-Lok 接头,已消毒)三通管100ml 烧杯20G …

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蛋白质的长期保存——以冻干固体的形式保存

一种按适当配方制造的冻干蛋白质制剂能够在几年内保持稳定,即使是在室温(Carpenter and Chang 1996) ;然而,冻干配方的最佳溶液组成和工艺条件的研制远远超出了典型学术实验室的能力范围。一个主要的困难是大多数实验室中所用的冻干机通常没有控制样品温度的能力,不能达到低水平的残留水(如低于质量的1%~2%),而低水平的残留水是冻干产品长期保存活 …

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单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系

在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前,应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量,可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后,应该将这些孔的细胞进行冻存,同时进行有限稀释。 附加材料 生长的杂交瘤 克隆和扩增用培养基 24 孔板 4ml 有盖试管,无菌 步骤 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 %汇合时(主 …

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真空浓缩仪的使用方法

  如果在乙醇沉淀后,核酸中还残留乙醇,就很难用水或缓冲液溶解沉淀。如果你急用或者需要去除大体积的挥发性液体,可以使用真空浓缩设备。真空浓缩设备由离心机、真空泵、加热器和冷凝装置组成,其组合模式多种多样,相关的实验室使用规则变化更多。 一、步骤 使用真空浓缩设备前至少30min 打开冷凝装置。在有些装置中,可能需要加入干冰。 打开真空泵。 开通风管以释放离心 …

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建立透析的方法步骤

1. 剪下一段足够装得下要透析物质的透析袋,在每个末端留下大概2 英寸(总共留下4英寸)来捆绑透析袋。(可以买到特殊的管子来进行微量的透析。)2. 透析袋的两端都要打结,或者用透析夹封住末端。3. 用戴手套的手打开透析袋的一个末端,另一个手拿住透析袋,把样品认真地装入透析袋中。4. 扎住或者夹住透析袋的末端,夹住之前先挤压赶走气泡,检查渗漏,尤其注意末端。5 …

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western-blot实验的影响因素有哪些?

1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量,蛋白变性是否充分等等,还有,蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外,蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高,分离胶的PH值应在8.8左右,而浓缩胶的PH应在6.8左右,最好不要差过0.5个PH单位,因为这 …

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