此方案概述了一个快速定量DNA 的方法,并同时分析其物理状态。溴化乙锭染色后,用UV 灯照射透视法可以发现包含>5ngDNA 的DNA 条带。CCD 照相机拍下未知样品的影像,然后与一系列已知含量标准品进行强度(灰度)对比,从而估计未知样品中DNA的含量。染色凝胶分析是一种快速的同时测量DNA 的数量并分析其物理状态的方式。 SYBR 染料也可用于染色并大致 …
阅读更多 »新型核酸分子荧光探针——分子信标的原理及应用
分子信标(molecular beacon)是一种具有发夹结构的新型荧光标记核酸探针,具有高灵敏度、高特异型,其在聚合酶链反应(PCR)、核酸序列的分析、活细胞内核酸的动态检测、蛋白质(酶)与核酸的相互作用等方面具有广泛的应用。 分子信标的结构 分子信标的结构一般包括三个部分:环状区、信标茎干区、荧光基团和猝灭基团。荧光基团一般联接在信标分子的5 端;猝灭基 …
阅读更多 »用测序酶进行标记/终止测序反应常见问题
问题 可能的原因 解决办法 四条泳道同一个位置都有条带,特别是靠近引物的地方 DNA 模板不纯 观察对照DNA 是否存在同样问题,如果不存在,重新制备模板DNA 试剂不纯或试剂老化;dNTP量不足 准备新鲜试剂 DNA 聚合酶活性低 使用新鲜制备的酶。 加入更多的酶,如每个反应多加4 倍。使用前再稀释酶. 将标记反应缩减至2 min, 将T7DNA 聚合酶从 …
阅读更多 »mRNA的分离
mRNA 在细胞总RNA 中占较小的比例,大量的是核糖体RNA。真核生物的mRNA分离方法利用了大多数mRNA 存在多聚腺苷酸尾巴(有一些mRNA 没有多聚腺苷酸的尾巴)。Poly(A) RNA 可以结合在有多聚寡核苷酸(dT) 的树脂上,在高盐的条件下寡聚胸苷酸-纤维素可以结合PolgA-mRNA, 在低盐的情况下洗脱。这种方法可以批量或者在一个小柱子上操 …
阅读更多 »碱变性法提取质粒DNA
质粒DNA提取的方法很多,有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭 – 氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种,但基本原理和步骤是一致的.包括以下步骤:(1)裂解菌体细胞;(2)质粒和染色体DNA的分离;(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分;(4)除去提取过程中使用的去垢剂、盐等。 一、原理 …
阅读更多 »做无菌实验前,你需要做好这些准备
工作区域尽可能地远离通风口和交通口。不应该开窗工作,也不要靠近门口。通风橱能够帮助无菌状态的保持,但它也不一定完全保证。 确保整洁的工作环境。拿走所有不用的仪器和设备,旧容器和箱子也不要放在近处,做完实验后,收拾干净实验台。 实验前用消毒剂或是清洁剂清洁工作区域。70 %的乙醇是最常用的(但也要根据不同实验室的情况决定,因为酒精不一定对那些特殊的污染物有效) …
阅读更多 »DNA 序列测定——双脱氧( Sanger ) 测序法
双脱氧法或酶法利用DNA 聚合酶合成单链DNA 模板的互补拷贝,这一方法最先由F. Sanger 及其合作者发展而来。DNA 聚合酶不能起始DNA 链的合成,而是在复性于“模板“DNA 的引物的3 ‘端上进行链的延伸(图1) 。链的延伸是在引物生长端的3′ 羟基掺入脱氧核糖核苷酸。双脱氧测序法利用了DNA 聚合酶能以2′, …
阅读更多 »动物基因组DNA的提取
实验原理 在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动构基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100-150 kb,适用于构建基因组文库和 Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤,以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。 仪器、材料与试剂 (一)仪器 1 . 台式离心机 2 …
阅读更多 »DNA 凝胶电泳注意事项
DNA胶用来分离、确定或者纯化DNA片段。用于DNA测序反应的测序胶不在这儿讨论。每位实验室成员有不同的制胶方法。 样品准备 6 X 上样缓冲液: 30% (V/V) 甘油, 0.25%(W/V) 溴酚蓝, 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝,蒸馏水配制。贮于-20’C 。 样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。 标准分子/分子 …
阅读更多 »做电泳实验必须要知道的基础知识
*样品制备 样品必须完全溶解于上样缓冲液,否则不能在凝胶中移动。样品太浓可能产生假相。 样品缓冲液包含盐类(维持样品)、甘油(增加重量从而使样品下沉至点样孔)、以及示踪染料(以便监测电泳进程)。 样品缓冲液可以分装成小部分冻存。 缓冲液加到凝胶上之后才能点样。 样品缓冲液中的示踪染料可以指示什么时候终止电泳。两种最常用的染料是漠酚蓝(BPB) 与二甲基苯青F …
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