工作区域尽可能地远离通风口和交通口。不应该开窗工作,也不要靠近门口。通风橱能够帮助无菌状态的保持,但它也不一定完全保证。 确保整洁的工作环境。拿走所有不用的仪器和设备,旧容器和箱子也不要放在近处,做完实验后,收拾干净实验台。 实验前用消毒剂或是清洁剂清洁工作区域。70 %的乙醇是最常用的(但也要根据不同实验室的情况决定,因为酒精不一定对那些特殊的污染物有效) …
阅读更多 »用测序酶进行标记/终止测序反应常见问题
问题 可能的原因 解决办法 四条泳道同一个位置都有条带,特别是靠近引物的地方 DNA 模板不纯 观察对照DNA 是否存在同样问题,如果不存在,重新制备模板DNA 试剂不纯或试剂老化;dNTP量不足 准备新鲜试剂 DNA 聚合酶活性低 使用新鲜制备的酶。 加入更多的酶,如每个反应多加4 倍。使用前再稀释酶. 将标记反应缩减至2 min, 将T7DNA 聚合酶从 …
阅读更多 »测序胶的灌制、电泳及处理
推荐用6 %丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶:一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息;另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程,采用6 %丙烯酰胺,可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶,使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。 材料 盛于喷射洗瓶的 …
阅读更多 »转子的类型及用途
转子主要有4 种类型:角式、外摆式、连续流式以及区带式。只有角式与外摆式转子是标准的实验室仪器,另外两种只用作专门用途。 角式转子 用途:样品浓缩。实验室中的“苦力” 。 说明:样品沿着与旋转平面成一定角度的方向离心。 优点:离心见效最快。物质具有更高的相对离心力,比在外摆式转子中沉降快。机器的活动组件少,损坏机会小。 缺点:物质被驱向离心管的管壁方向,然后 …
阅读更多 »Trizol法提取总RNA的原理及注意事项
原理:Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能析出有机层的 …
阅读更多 »mRNA的分离
mRNA 在细胞总RNA 中占较小的比例,大量的是核糖体RNA。真核生物的mRNA分离方法利用了大多数mRNA 存在多聚腺苷酸尾巴(有一些mRNA 没有多聚腺苷酸的尾巴)。Poly(A) RNA 可以结合在有多聚寡核苷酸(dT) 的树脂上,在高盐的条件下寡聚胸苷酸-纤维素可以结合PolgA-mRNA, 在低盐的情况下洗脱。这种方法可以批量或者在一个小柱子上操 …
阅读更多 »RNA沉淀方法
乙醇沉淀RNA通常RNA 可以像DNA 一样沉淀。步骤1. 加入1/10 体积1 mol/L 的NaOAc (pH4. 8) 和2.5 倍体积冷的95 %的乙醇。2.-20 ℃ 下沉淀过夜。3. 用70 %的乙醇洗涤沉淀。注意:当你处理少量RNA 的时候(低于5 μg) ,在RNA 沉淀之前加入一些载体或者共沉淀物,这类物质将帮助沉淀RNA, 更容易看见沉淀 …
阅读更多 »实时荧光定量PCR为什么倍受青睐?
一、 实时荧光定量PCR技术是一种新型的科学定量方法,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。 二、 目前,荧光定量PCR所使 …
阅读更多 »在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能
本方案描述了将ASO 转入果蝇S2 细胞以便抑制miRNA 功能的方法。通过检测miRNA靶蛋白水平或miRNA 靶基因3UTR 报道基因的活性,可以检测ASO 对miRNA 的效应。本方案是针对24 孔板设计的,若用其他多孔板、培养瓶或不同直径培养皿,应根据其表面积计算细胞密度和试剂体积 。 试剂 ASO ( 12.5μmol/L ) 和错配和/或无关对照 …
阅读更多 »聚丙烯酰胺凝胶的配制
表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液 不同体积(ml)凝胶液中各成分所需体积(ml) 溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50 6% 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10 1.5 mol/L Tris (pH …
阅读更多 »