此方案概述了一个快速定量DNA 的方法,并同时分析其物理状态。溴化乙锭染色后,用UV 灯照射透视法可以发现包含>5ngDNA 的DNA 条带。CCD 照相机拍下未知样品的影像,然后与一系列已知含量标准品进行强度(灰度)对比,从而估计未知样品中DNA的含量。染色凝胶分析是一种快速的同时测量DNA 的数量并分析其物理状态的方式。 SYBR 染料也可用于染色并大致 …
阅读更多 »异丙醇法沉淀DNA
DNA 在含有异丙醇的溶液中比在含有乙醇的溶液中难溶。乙醇沉淀法需要2 ~ 3 倍体积的乙醇,异丙醇沉淀则需要0.6 ~ 0.7 倍的体积。沉淀大体积溶液中的DNA 时,异丙醇是比较好的选择。在室温用异丙醇沉淀减少了一些蔗糖或者氯化钠和DNA 发生共沉淀的现象。但异丙醇还是有一些不足之处: 盐在35 %的异丙醇溶液中比在65 %的乙醇溶液中难溶。 DNA 沉 …
阅读更多 »Real-Time qPCR常见的八大问题分析
1. 无Ct值出现 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Ct值出现过晚(Ct>38) 扩增效率低: 反应条 …
阅读更多 »揭秘RNAi,缔造实验神话
用siRNA进行transient transfection不稳定,几代细胞以后,症状就会消失,所以在转染几天(1-3)后要立刻抽提蛋白,进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染,如果质粒含有抗生素位点,可以进行筛选,获得较稳定的细胞株系,但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染(infection),抗生素筛选后,可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …
阅读更多 »荧光原位杂交会用到哪些试剂?
一、实验材料、试剂、仪器耗材: 人的MyoD1(MYF3)基因探、人外周血中期染色体细胞标本指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20等恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等 二、相关溶液的配制 (1)20×SSC:175.3 g NaCl,88.2 g柠檬酸钠,加水至1 00 …
阅读更多 »RNA的提取方法及原理
RNA提取原理 RNA提取时,加氯仿后分三层:水相(含rna,可能还有少量DNA),中间白色薄层(应该是蛋白和DNA),下层有机相(氯仿和蛋白等) 氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取RNA时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和DNA脱离,DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DN …
阅读更多 »cDNA文库构建分为哪些阶段?
cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链,然后除掉mRNA,以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …
阅读更多 »分子生物学常用贮存液的配制
分子生物学常用贮存液的配制 1.30%丙烯酰胺溶液 【配制方法】将29g 丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml。用滤器(0.45μm 孔径)过滤除菌,查证该溶液的pH 值应不大于7.0,置棕色瓶中保存于室温。 【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称 …
阅读更多 »测序胶的灌制、电泳及处理
推荐用6 %丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶:一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息;另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程,采用6 %丙烯酰胺,可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶,使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。 材料 盛于喷射洗瓶的 …
阅读更多 »真空浓缩仪的使用方法
如果在乙醇沉淀后,核酸中还残留乙醇,就很难用水或缓冲液溶解沉淀。如果你急用或者需要去除大体积的挥发性液体,可以使用真空浓缩设备。真空浓缩设备由离心机、真空泵、加热器和冷凝装置组成,其组合模式多种多样,相关的实验室使用规则变化更多。 一、步骤 使用真空浓缩设备前至少30min 打开冷凝装置。在有些装置中,可能需要加入干冰。 打开真空泵。 开通风管以释放离心 …
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