2025年 3 月 15日, 星期六
新闻

核酸基因

shRNA转染后,什么时候做RT-PCR最好?

shRNA转染后,进行RT-PCR的最佳时间取决于多种因素,包括细胞类型、转染效率、shRNA的表达和目标基因的降解速度。一般来说,在转染后的24到72小时内进行RT-PCR是比较常见的时间点。具体来说: 24小时后:在这个时间点,可以开始检测到shRNA的表达以及目标基因的初步下调情况。对于一些高效的shRNA,这个时间点可能已经有显著的基因沉默效果。 4 …

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EMSA实验步骤

一、探针的标记 如下设置探针标记的反应体系: (1)待标记探针 (1.75 pmol/μl) :2μl (2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1μl (3)Nuclease-Free Water :5μl (4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1μl (5)T4 P …

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DNA 的 PCR 扩增

一、 PCR反应体系的组成 1.PCR扩增缓冲液: 50mM     KCl10mM    Tris HCl( pH8.0)1.5mM   MgCl2 2.寡核苷酸引物:是按已知待扩增的DNA 片段序列进行设计,用 DNA合成仪合成。引物序列应位于DNA片段的保守区,两条引物间应注意不要有 …

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PCR扩增产物出现杂带怎么办?

可能的原因和对应的解决方案如下: 1.引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 2.循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。 3.酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。 4.退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的 pcr 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR …

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如何将胶内物质转移到膜上?

凝胶是厚而易碎的基质,这使得操作与温浴都很困难。如果要对胶内的内容物进行杂交,必须将内容物从凝胶引导到硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。这一过程称为转移。 转移之后,滤膜与一个探针温浴,观察探针是否能与滤膜上的分子杂交。探针由放射性元素或者其他指示剂标记,所以可以被检测。滤膜与探针的杂交称为印迹。 第一次使用印迹技术是由Southern 描述的, 因此, 这种印迹被 …

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微型凝胶电泳后使用溴化乙锭(EB)估算条带中DNA 数量

此方案概述了一个快速定量DNA 的方法,并同时分析其物理状态。溴化乙锭染色后,用UV 灯照射透视法可以发现包含>5ngDNA 的DNA 条带。CCD 照相机拍下未知样品的影像,然后与一系列已知含量标准品进行强度(灰度)对比,从而估计未知样品中DNA的含量。染色凝胶分析是一种快速的同时测量DNA 的数量并分析其物理状态的方式。 SYBR 染料也可用于染色并大致 …

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cDNA文库构建分为哪些阶段?

cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链,然后除掉mRNA,以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …

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siRNA表达载体的构建

siRNA表达载体构建可以:(1)作为后基因组时代基因功能分析的有力工具;(2)应用于基因组学、细胞信号传导通路分析;(3)用于药物靶点筛选、疾病治疗。 实验方法原理: 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启 …

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RNA沉淀方法

乙醇沉淀RNA通常RNA 可以像DNA 一样沉淀。步骤1. 加入1/10 体积1 mol/L 的NaOAc (pH4. 8) 和2.5 倍体积冷的95 %的乙醇。2.-20 ℃ 下沉淀过夜。3. 用70 %的乙醇洗涤沉淀。注意:当你处理少量RNA 的时候(低于5 μg) ,在RNA 沉淀之前加入一些载体或者共沉淀物,这类物质将帮助沉淀RNA, 更容易看见沉淀 …

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SDS 碱裂解法制备质粒DNA: 少量制备

该实验方案是从少量( l ~ 2mL ) 细菌培养物中分离质粒DNA 。DNA 产量为l00ng~ 5μg , 这取决于质粒的拷贝数。少量的DNA 作为体外酶促反应的底物或者模板是足够的,但是,如果质粒DNA 用于测序则需要进一步纯化。 很多年以来, 碱裂解法提取质粒DNA 一直是标准的方法。如今,人们更倾向于用试剂盒提取。下列方案是早期实验的回顾。 材料 …

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