2025年 3 月 15日, 星期六
新闻

核酸基因

小RNA 的Northern 杂交分析

该方案描述如何运用Northern 杂交检测15~150 个核昔酸的小RNA (图1) 。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总RNA, 再采用半干法进行转膜。RNA 通过紫外线照射交联至尼龙膜上,在Church 缓冲液中对RNA 和α-32p标记的寡核昔酸探针进行杂交,并用磷酸成像分析技术(phosphorimager analysis) 进行检测分析。使用包含两个 …

阅读更多 »

大肠杆菌转化实验(热击法)

  大肠杆菌转化可以:(1)将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,以获得目的基因;(2)验证大肠杆菌感受态细胞效果;(3)用于分子生物学其他研究。 1原理: 质粒DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。 2器材: 旋 …

阅读更多 »

PCR实验步骤及常见问题汇总

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。 一、    聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成: ①    …

阅读更多 »

反转录定量PCR 分析小RNA

Northern 杂交可以揭示小RNA 的表达水平,同时也可揭示小RNA 的长度,并且是小RNA 验证和定量的标准。然而, Northern 杂交不能用来检测低丰度小RNA, 也不能检测大量的小RNA 种类。相比之下,定量RT-PCR 更加敏感并且可以适用于高通量处理(图1) 。 图1 小RNA 定量RT-PCR 分析流程图。 试剂 mirVana miRN …

阅读更多 »

原位PCR原理与操作步骤

原位PCR 在科学研究中,每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世,从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域,50年代电子显微镜引入形态学观察领域,带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究;60-70年代,免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用,又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平,使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位,对医 …

阅读更多 »

cDNA文库构建分为哪些阶段?

cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链,然后除掉mRNA,以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …

阅读更多 »

荧光原位杂交会用到哪些试剂?

一、实验材料、试剂、仪器耗材: 人的MyoD1(MYF3)基因探、人外周血中期染色体细胞标本指甲油、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温20等恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等 二、相关溶液的配制 (1)20×SSC:175.3 g NaCl,88.2 g柠檬酸钠,加水至1 00 …

阅读更多 »

PCR (多聚酶链式反应)

PCR 是1985 年由Kary Mulis 在Cetus 公司发明的,是一种体外复制和扩增DNA的方法。 DNA模板首先在高温下变性,当温度降低时,DNA 两侧的寡核苷酸引物与互补序列结合,在DNA聚合酶作用下,随着温度的缓慢提升,引物逐渐延伸,两条引物之间的区域被合成。然后DNA再次变性,引物再次结合,DNA的合成再次进行,这样周而复始,重复20  …

阅读更多 »

如何制备双链siRNA?

本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。 试剂 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺(19 : 1, 40%, m/V)过硫酸铵( 10%, m/V) 复性缓冲液(10 X ) 2‘ 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸,用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH …

阅读更多 »

采用dsRNA 浸泡果蝇S2 细胞进行RNA 干扰

该方案是一种通过用含有dsRNA 的培养液浸泡果蝇S2 细胞来诱导RNA 干扰的简便方法。与转染方法相比,浸泡操作需要的步骤更少,因此可用于高通量的RNA 干扰筛选。而且, 浸泡避免了转染试剂可能带来的毒性,但是,通过浸泡向果蝇S2 细胞转运dsRNA 的效率与转染方法相比较低。对于通过浸泡dsRNA 难以抑制其表达的基因,可以通过多次转染dsRNA 获得抑 …

阅读更多 »