该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。 试剂 琼脂糖凝胶( 1 %)复性缓冲液( 10 X)ATP 、CTP 、GTP 、UTP ( 每种100mmol/L )二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)DNA 分子质量标准dNTP 混合液,每种1 …
阅读更多 »mRNA的分离
mRNA 在细胞总RNA 中占较小的比例,大量的是核糖体RNA。真核生物的mRNA分离方法利用了大多数mRNA 存在多聚腺苷酸尾巴(有一些mRNA 没有多聚腺苷酸的尾巴)。Poly(A) RNA 可以结合在有多聚寡核苷酸(dT) 的树脂上,在高盐的条件下寡聚胸苷酸-纤维素可以结合PolgA-mRNA, 在低盐的情况下洗脱。这种方法可以批量或者在一个小柱子上操 …
阅读更多 »mRNA的分离纯化原理
【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子,是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物,因此,高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1×10-5g RNA,理论上认为每克细胞可分离出5~10mg RNA。其中rRNA为75%~ 85%,tRNA占1 …
阅读更多 »如何提高PCR反应的特异性?
1、巣式pcr(Nest-PCR)可增加稀有靶序列的灵敏度;降低了扩增多个靶位点的可能性;提高PCR特异性 2、递减PCR(Touch Down PCR):前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性;循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃ 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。 3、热启动PCR:抑制 …
阅读更多 »双脱氧法和化学测序法如何选择?
双脱氧测序法速度快。引物的复性和测序可以在60~90 min 内完成。可以同时制备大量的单链或双链测序样品。如果用35 S标记的dNTP 测序,这种方法可以提供极好的(电泳)条带的分辨率。其主要缺点是模板的组成或二级结构有时会导致测序过早地终止。虽然和Klenow 片段相比,有其他的聚合酶可以减轻这个问题,但有些DNA 序列还是无法用双脱氧法精确地测出来。 …
阅读更多 »微型凝胶电泳后使用溴化乙锭(EB)估算条带中DNA 数量
此方案概述了一个快速定量DNA 的方法,并同时分析其物理状态。溴化乙锭染色后,用UV 灯照射透视法可以发现包含>5ngDNA 的DNA 条带。CCD 照相机拍下未知样品的影像,然后与一系列已知含量标准品进行强度(灰度)对比,从而估计未知样品中DNA的含量。染色凝胶分析是一种快速的同时测量DNA 的数量并分析其物理状态的方式。 SYBR 染料也可用于染色并大致 …
阅读更多 »逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
一、原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的 …
阅读更多 »碱-SDS 质粒小量制备
小量制备可以从细菌培养物中抽提和分析,离心机12 或16 管足够一次制备。 一、材料 5 ml 过夜培养细菌培养物。使用LB培养基加入合适的抗生素培养单克隆菌体,37’C 振荡培养 灭菌的微桩离心管 冰 溶液I (裂解缓冲液, 25 mmol/L Tr的HCI pH8.0, 50 mmol/L葡萄糖, 10 mmol/LEDTA) ,冰上预冷 溶 …
阅读更多 »常用抗生素溶液有哪些?
贮存液a 工作浓度 抗生素 浓度 保存条件 严紧型质粒 松弛型质粒 氨苄青霉素 50mg/ml(溶于水) -20℃ 20μg/ml 60μg/ml 羧苄青霉素 50mg/ml(溶于水) -20℃ 20μg/ml 60μg/ml 氯霉素 34mg/ml(溶于乙醇) -20℃ 25μg/ml 170μg/ml 卡那霉素 10mg/ml(溶于水) -20℃ 10μ …
阅读更多 »RNA 定量-紫外(UV) 分光光度法
在进行大多数RNA 分析之前, RNA 定量是一种重要和必需的步骤。RNA 定量方法可以分为两类:紫外(UV) 分光光度法,此方法基于嘌呤和嘧啶碱基的吸收光谱; 基于荧光染料的方法,结合到核酸时选择性发荧光,测定荧光染料的强度。如果RNA 样品是纯的( 如没有诸如蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染),用UV 分光光度法测量被碱基吸收的UV 射线简单而且精确。 …
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