Northern 杂交可以揭示小RNA 的表达水平,同时也可揭示小RNA 的长度,并且是小RNA 验证和定量的标准。然而, Northern 杂交不能用来检测低丰度小RNA, 也不能检测大量的小RNA 种类。相比之下,定量RT-PCR 更加敏感并且可以适用于高通量处理(图1) 。 图1 小RNA 定量RT-PCR 分析流程图。 试剂 mirVana miRN …
阅读更多 »siRNA是从牵牛花过表达发现的吗
siRNA(small interfering RNA, 小干扰RNA)并不是从牵牛花的过表达现象中发现的,而是从研究植物基因沉默和RNA干扰现象中逐步发展起来的。siRNA的发现归功于对基因沉默和RNA干扰机制的研究,尤其是科学家在植物、真菌和线虫等生物中对这些现象的观察和研究。 siRNA发现的关键研究 植物基因沉默:在植物中,科学家观察到特定基因可以在 …
阅读更多 »PCR (多聚酶链式反应)
PCR 是1985 年由Kary Mulis 在Cetus 公司发明的,是一种体外复制和扩增DNA的方法。 DNA模板首先在高温下变性,当温度降低时,DNA 两侧的寡核苷酸引物与互补序列结合,在DNA聚合酶作用下,随着温度的缓慢提升,引物逐渐延伸,两条引物之间的区域被合成。然后DNA再次变性,引物再次结合,DNA的合成再次进行,这样周而复始,重复20 …
阅读更多 »普通PCR的基本原理和注意事项
1、概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早于1955年发现,而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. K …
阅读更多 »离心机的种类
有很多关于离心机类型的描述性术语,但那些不是严格的定义。在实验室中,离心机通常以制造者的名字相称。 高速与超速离心机都带有冷冻装置,之所以需要冷冻是因为高速离心会产生热。其他离心机有带或不带冷冻装置的型号。 台式离心机, 也称为多用途离心机。不一定放在实验台上,反而经常放在桌子底下。 用途:沉淀细胞与细菌、酚抽提。 g 值与每分钟旋转次数: 角式17000 …
阅读更多 »mRNA的分离
mRNA 在细胞总RNA 中占较小的比例,大量的是核糖体RNA。真核生物的mRNA分离方法利用了大多数mRNA 存在多聚腺苷酸尾巴(有一些mRNA 没有多聚腺苷酸的尾巴)。Poly(A) RNA 可以结合在有多聚寡核苷酸(dT) 的树脂上,在高盐的条件下寡聚胸苷酸-纤维素可以结合PolgA-mRNA, 在低盐的情况下洗脱。这种方法可以批量或者在一个小柱子上操 …
阅读更多 »shRNA转染后,什么时候做RT-PCR最好?
shRNA转染后,进行RT-PCR的最佳时间取决于多种因素,包括细胞类型、转染效率、shRNA的表达和目标基因的降解速度。一般来说,在转染后的24到72小时内进行RT-PCR是比较常见的时间点。具体来说: 24小时后:在这个时间点,可以开始检测到shRNA的表达以及目标基因的初步下调情况。对于一些高效的shRNA,这个时间点可能已经有显著的基因沉默效果。 4 …
阅读更多 »做无菌实验前,你需要做好这些准备
工作区域尽可能地远离通风口和交通口。不应该开窗工作,也不要靠近门口。通风橱能够帮助无菌状态的保持,但它也不一定完全保证。 确保整洁的工作环境。拿走所有不用的仪器和设备,旧容器和箱子也不要放在近处,做完实验后,收拾干净实验台。 实验前用消毒剂或是清洁剂清洁工作区域。70 %的乙醇是最常用的(但也要根据不同实验室的情况决定,因为酒精不一定对那些特殊的污染物有效) …
阅读更多 »cDNA文库构建分为哪些阶段?
cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链,然后除掉mRNA,以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …
阅读更多 »SDS 碱裂解法制备质粒DNA: 大量制备
近些年来,随着PCR 技术的出现,以及DNA 克隆和测序方法的发展,对大量质粒载体和重组子的需求也大大减少。因此,本方案曾一度广泛应用,但已经被更为快速和简便的柱纯化方法代替。在本方案中,通过碱裂解法的放大( Bimboim and Doly 1979 ) ,质粒DNA 可从清亮的细菌裂解物中通过含有溴化乙锭的CsCl 梯度离心来进行纯化。 无论是高拷贝数的 …
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