长链dsRNA 的导入能够在小鼠卵母细胞、早期胚胎、胚胎干细胞和胚胎癌细胞( Svoboda et al. 2000; Wianny and Zemicka-Goetz 2000; Billy et al. 2001; Yang et al. 2001),以及植物、蠕虫、果蝇体内诱导特定和高效的RNA 干扰。但是,早期在哺乳动物体细胞中用长链dsRNA 诱导 …
阅读更多 »构建小RNA 高通量测序文库
小RNA 克隆和高通量测序的结合是纯化和鉴别细胞或组织中小RNA 的有效先进技术。本方案描述了用于Illumina Genome Analyzer 高通量分析的19 ~ 29 个核苷酸小RNA 的克隆方法,通过聚丙烯酰胺凝胶从总RNA 样品中分离纯化小RNA, 并进行两步连接反应:小RNA3′ 端与5′ 腺苷酸DNA 连接物的连接;以 …
阅读更多 »聚丙烯酰胺凝胶的配制
表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液 不同体积(ml)凝胶液中各成分所需体积(ml) 溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50 6% 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10 1.5 mol/L Tris (pH …
阅读更多 »RNA 凝胶电泳注意事项
RNA 凝胶是用Northern 印迹的方法来分析RNA 。mRNA 大约只占总RNA 的5% ,在溴化乙锭染色的胶上看不到,因此mRNA 必须用标记探针来检测。 *样品制备 RNA 样品在电泳之前及电泳过程中必须是变性的,否则不能精确测定分子质量。变性是由甲醛与甲酰胺来完成的,也可用乙二醛和二甲亚砜或甲基苯(不推荐)。 MOPS 胶的样品缓冲液: 0.75 …
阅读更多 »如何制备双链siRNA?
本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。 试剂 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺(19 : 1, 40%, m/V)过硫酸铵( 10%, m/V) 复性缓冲液(10 X ) 2‘ 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸,用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH …
阅读更多 »普通PCR的基本原理和注意事项
1、概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早于1955年发现,而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. K …
阅读更多 »慢病毒感染后,未能实现相关敲降的原因是什么?
慢病毒感染后未能实现敲降的原因可能有多种。以下是一些可能的原因及其解释: 慢病毒包装质量问题: 病毒滴度较低,导致感染效率不高,可能无法有效转导目标细胞。 病毒颗粒中没有足够的有效载体,影响敲降效果。 靶向序列设计问题: shRNA或sgRNA设计不合理,没有有效靶向目标基因的序列。 目标序列与基因组其他部位的相似性导致脱靶效应,影响敲降效果。 感染条件不佳 …
阅读更多 »降落PCR实验原理及步骤
降落PCR(touchdown PCR),一种PCR技术,主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行,例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低,但退火温度过低则会使非特异扩增过多。 实验材料: 基因样品 仪器、耗材: PCR仪 实验步骤: 1、反应体积为50 μl。 2、人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系:CD1 …
阅读更多 »如何评估Real-time qPCR定量检测?
一、Real-time qPCR定量方法 可以分为绝对定量和相对定量。 绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线,在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较,从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ssDNA。 相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值 …
阅读更多 »南京中医药大学:忍冬苷靶向EZH2减轻溃疡性结肠炎通过自噬介导NLRP3炎性体失活
结肠巨噬细胞内NLRP3炎症小体的异常激活与溃疡性结肠炎的发生发展密切相关。虽然靶向NLRP3炎症小体被认为是一种潜在的治疗方法,但其调节肠道炎症的潜在机制仍存在争议。 2021年3月9日,发表于Acta Pharmaceutica Sinica B(影响因子11.413)的一篇题为Lonicerin targets EZH2 toalleviate ulc …
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