分子生物学

PCR 是通过热稳定酶，在模板、dNTPs 和一组与片段3′ 序列互补的引物存在下，对插入物进行次序扩增(Saiki et al. 1988) 。PCR 技术提供的另一优势是在对插入片段的扩增中掺入修正的核苷酸，因此可以生产出不含载体的标记的探针，这排除了在其他方法如缺口翻译所导致的对载体序列的非特异性标记。 目前已有掺入生物素化核苷酸的方法(L …

RNA提取原理 RNA提取时，加氯仿后分三层：水相(含rna,可能还有少量DNA），中间白色薄层（应该是蛋白和DNA），下层有机相（氯仿和蛋白等） 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DN …

DNA胶用来分离、确定或者纯化DNA片段。用于DNA测序反应的测序胶不在这儿讨论。每位实验室成员有不同的制胶方法。 样品准备 6 X 上样缓冲液： 30% (V/V) 甘油， 0.25%(W/V) 溴酚蓝， 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝，蒸馏水配制。贮于－20’C 。 样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。 标准分子／分子 …

准备阶段：1.180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。 制胶： 1. 称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入 …

材料 SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞系（药物标记的非分泌型； ATCC) 添加10mmol/L HEPES 和1mmol/L 丙酮酸钠的DMEM- 10 和DMEM-20 完全焙养基 免疫的实验动物：小鼠、大鼠或仓鼠（在初次接种后10~14d 备用) 50% （m/V) PEG 溶液，无菌 DMEM 完全培养基，未添加血清 氯化铵溶液： 0. 02mol/ …

对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列 为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。 选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 在转染前要确认 …

AMPK是细胞极为重要的能量感受器，当细胞处于能量匮乏的状态时AMPK会被激活，AMPK激活后可以磷酸化不同的下游底物从而促进分解代谢和抑制合成代谢，最终使细胞达到能量平衡状态。  UHRF1是至关重要的DNA甲基化调控因子，它参与DNA维持甲基化过程的功能已经研究的比较清楚。另外，还有研究表明UHRF1参与DNA的损伤修复。但除此之外，UHRF1是否能直接 …

可能的原因和对应的解决方案如下： 1.引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 2.循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。 3.酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。 4.退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 pcr 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR …

原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的 …

慢病毒感染效率低，尽管用胶体金测试显示滴度很高，可能有以下几个原因： 病毒颗粒质量：虽然胶体金检测显示病毒滴度很高，但这并不意味着所有的病毒颗粒都是功能性的。有可能病毒颗粒已经失活或者结构受损，无法有效感染目标细胞。 病毒浓度与效价的差异：胶体金检测主要测量病毒颗粒的数量，但这些颗粒不一定都具有感染性。有效感染的病毒颗粒（感染性单位）可能比实际检测的数量要低 …