英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。 试剂 丙烯酰胺： 双丙烯酰胺（19 : 1, 40%, m/V)过硫酸铵( 10%, m/V) 复性缓冲液（10 X ) 2‘ 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸，用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH …
阅读更多 »western-blot化学发光时，出现非特异条带，该怎么办？
出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …
阅读更多 »影响western-blot实验的因素有哪些？
1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为 …
阅读更多 »DNA 凝胶电泳注意事项
DNA胶用来分离、确定或者纯化DNA片段。用于DNA测序反应的测序胶不在这儿讨论。每位实验室成员有不同的制胶方法。 样品准备 6 X 上样缓冲液： 30% (V/V) 甘油， 0.25%(W/V) 溴酚蓝， 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝，蒸馏水配制。贮于－20’C 。 样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。 标准分子／分子 …
阅读更多 »透析袋的准备工作
透析被用于从样品中除去盐和其他杂质，样品被放置在一个多孔的透析袋中，只允许比孔小的分子流出。透析袋被放在大体积的水或者缓冲液中，允许内容物外流，最后通过透析缓冲液把透析袋中的缓冲液取代。透析袋在使用前要洗净，所有的操作都要带手套。1. 根据合适的分子量截留选择透析袋。2. 准备透析袋，做成一个口袋，4’C 储存。3. 将透析袋放在一个大体积的烧杯 …
阅读更多 »western-blot实验心得
我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存 …
阅读更多 »AFLP原理和操作步骤
AFLP是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。本AFLP 技术主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危 …
阅读更多 »蛋白质的保存方法如何选择？
保存方法的选择取决于几个因素，包括蛋白质内在的稳定性、所需的保存时间的长短和对于防止破坏所要求的程度。这些因素有很大的变异性，但是，在大多数情况下都应当遵守以下常规的准则。 如果仅仅是要将小批量的纯化蛋白质保存约几天的时间，那么通常只要以非冷冻的溶液形式4°C保存即可，如果需要保存较长的时间，或如果有明显的蛋白质降解（如可见的沉淀物或不可接受的功能损失），那 …
阅读更多 »单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系
在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。 附加材料 生长的杂交瘤 克隆和扩增用培养基 24 孔板 4ml 有盖试管，无菌 步骤 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 ％汇合时（主 …
阅读更多 »如何将胶内物质转移到膜上？
凝胶是厚而易碎的基质，这使得操作与温浴都很困难。如果要对胶内的内容物进行杂交，必须将内容物从凝胶引导到硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。这一过程称为转移。 转移之后，滤膜与一个探针温浴，观察探针是否能与滤膜上的分子杂交。探针由放射性元素或者其他指示剂标记，所以可以被检测。滤膜与探针的杂交称为印迹。 第一次使用印迹技术是由Southern 描述的， 因此， 这种印迹被 …
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