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1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮 …

1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮 …

1）优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外，可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂。 2）抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸 …

超净工作台(clean bench)是为了适应现代化工业、光电产业、生物制药以及科研试验等领域对局部工作区域洁净度的需求而设计的。超净工作台原理是在特定的空间内，室内空气经预过滤器初滤，由小型离心风机压入静压箱，再经空气高效过滤器二级过滤，从空气高效过滤器出风面吹出的洁净气流具有一定的和均匀的断面风速，可以排除工作区原来的空气，将尘埃颗粒和生物颗粒带走，以形 …

1， 质粒的构建：启动子的选择 启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。 2， 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率 …

特异性差，出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20 …

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程   ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为2 …

1. 电穿孔法。通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔。DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂，但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡 …

1. 脂质体法。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质 …

    我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些 …