英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
下面以我们实验室所用的Entranster-R4000试剂为例，说一下siRNA转染步骤（24孔板） 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数 …
阅读更多 »怎样有效提高细胞转染实验效率？
1．选择合适的转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如英格恩的 …
阅读更多 »细胞转染效率影响因素
转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个： 1．转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低 …
阅读更多 »细胞RNA转染实验注意事项
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »这年头谁还不会做个ELISA
这年头，学生物的不会做个ELISA，都不好意思出门。做ELISA 容易，把ELISA 做好至少要掌握以下几点： 如何选择合适的阳性对照? 阳性对照的基本组成应该尽量与检测样本的组成一致，一般阳性对照多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，加入一定量的待检物质。比如，以人血清为标本的测定，阳性对照多用确定的病人血清或者以复钙人血浆为原料加入一定量标准品。 如何选择合适 …
阅读更多 »细胞电转染实验应注意事项
1. 选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. …
阅读更多 »流式检测细胞周期操作步骤
细胞培养： 取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。 细胞固定： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。 3. 细胞染色： 1500rpm离心5min，弃上清，以3 …
阅读更多 »体内转染（entranster）与fbxw5减少可减轻脊髓损伤研究
外伤性脊髓损伤（SCI）是造成死亡和终身残疾的主要原因。然而，对脊髓损伤的病理过程还没有完全了解。F-BOX/WD重复序列包含蛋白5（FBXW5），是scf型E3泛素连接酶复合物的一个亚单位，在调节各种病理方面具有重要作用。然而，对于fbxw5对SCI进展的影响知之甚少。 现分享一篇体内转染（entranster）与fbxw5减少可减轻脊髓损伤 …
阅读更多 »western-blot实验经验总结
我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变 …
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