1.DEAE-葡聚糖。这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子,使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克,也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染,可重复性好,转染时要除掉血清。 2.磷酸钙共沉淀转染。最早在197 …
阅读更多 »通过MTT 法分析细胞活力
在众多依赖于活细胞将底物转化为生色产物的活力检测方法中,由Mossman ( 1983 )建立的MTT 法仍是最通用、最流行的方法之一。在MTT 法中,水溶性的黄色染料MTT [3-(4 , 5 - 二甲基噻唑-2)-2 , 5 -二苯基四唑溴盐] 在线粒体还原酶作用下转化为不溶性的紫色甲臜( 图1 ) 。随后甲臜被溶解,其浓度通过570nm 下的OD 值被 …
阅读更多 »RNA细胞转染实验注意事项
进行RNA细胞转染实验时,应注意以下几点: 1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中R …
阅读更多 »siRNA细胞转染效率低的原因是什么?
1. siRNA与转染试剂比例不佳 由于siRNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了siRNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率和总的细胞数量就很重要,一般细 …
阅读更多 »细胞培养该不该加抗生素?
细胞有没有正常生长,或细胞是否污染,是细胞培养的关键。虽然,顺利的时候,细胞培养起来很简单,可不顺的时候就会出现各种问题——-细胞污染啦、细胞生长缓慢啦、细胞形态看着不对劲啦、死细胞率多啦。。。。。。。。毕竟,细胞作为一种体外培养的物质,受许多外界因素的影响,培养基、血清、孵育温度,CO2浓度。。。。。。除此之外,还有一种影响因素就是 …
阅读更多 »为什么脂质体细胞转染试剂会造成细胞毒性?
已有众多的文献报道,脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC(蛋白激酶C)通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30);如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777 …
阅读更多 »电转染实验时,siRNA有什么要求?
使用Entranster-E试剂进行电转染实验时,要求使用纯度高、无菌且序列正确的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。尝试在250-750nM最终浓度范围内的siRNA浓度。Engreen建议导入一个非靶向或无意义的siRNA控制序列,以验证siRNA的基因特异性。此外,针对具有多个siRNA序列的基因可确保产生的表型不是由于脱靶效应所致 …
阅读更多 »脂质体细胞转染试剂的缺点
已有众多的文献报道,脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC(蛋白激酶C)通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30);如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777(4):362-8);如与线粒体膜发生作用(J Biol Chem. 19 …
阅读更多 »细胞电转染实验的几点建议
1. 电场强度要合适 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞状态要好 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2 …
阅读更多 »细胞转染实验的不同方法
1.DEAE-葡聚糖。这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子,使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克,也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染,可重复性好,转染时要除掉血清。 2.磷酸钙共沉淀转染。最早在1973年 …
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