细胞转染

对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列 为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。 选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 在转染前要确认 …

Q1：如果慢病毒载体中没有抗性标记，只有GFP，请问还能筛选稳转的细胞传代培养吗？ A1：采用流式分选是流式细胞仪的一个功能，有流式细胞仪就可以了。一般实验室对流式都有专门的人员操作，不需要自己动手。由于没有抗性，需要注意分选过程的无菌操作。 Q2：RNA干扰如果用慢病毒做稳转的细胞株，什么样的目的RNA都可以用来干扰来做稳转的细胞株吗，目的RNA所编码蛋白 …

1.细胞密度 　　一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 　　这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 　　还有，尽量选择无 …

为保证RNA转染的高效率，在转染过程中应注意： 1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境 …

       对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。推荐Entranster-E电转染试剂，可将电击对细胞的损伤降到最低。转染效率的确定，常用的是流式细胞仪检测的方法。

图1 乳酸脱氢酶催化的可逆反应 常用的细胞毒性测定方法的基础是测量受损细胞释放的胞浆酶的活性。乳酸脱氢酶( LDH ) 是一种所有细胞中均存在的稳定的胞浆酶。在不同类型的组织中存在5 种不同的乳酸脱氢酶异构体，它们在数量、特异性和酶作用动力学方面存在差异。但所有不同的酶异构体均催化相同的丙酮酸和乳酸相互转化，伴随着NADH 氧化为NAD+的反应（图1) 。当 …

通常在进行慢病毒感染后，建议遵循以下操作步骤： 感染后观察细胞状态：感染后一般在48-72小时内可以看到较为明显的表达，但是否开始筛选需要看细胞的状态和感染效率。如果细胞长满了，可以考虑先进行传代，以避免细胞过度拥挤影响生长和感染效果。 喷霉素筛选的时机：喷霉素通常在感染后48-72小时开始筛选，但实际开始筛选的时间取决于感染效率和细胞状态。如果细胞感染后状 …

进行RNA细胞转染实验时，应注意以下几点： 1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中R …

1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …

1.准备不足 做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。 2.细胞污染 细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步 …