2025年 1 月 1日, 星期三
新闻

细胞转染

细胞DNA转染效率低的原因

DNA转染效率低的原因可从以下几方面找: 1.质粒DNA或混和液中含有血清。 对策:用无血清培养基或Opti-MEM培养基。 2.质粒DNA和转染试剂的比率不是最优 对策:对大多数细胞而言,质粒DNA和转染试剂的比例为1:2-1:3,一般要做优化实验,比例从1:0.5-1:5 逐一检测。 3.质粒DNA 已部分降解或质量不够好 对策:用好的质粒纯化试剂确保质 …

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提高细胞转染效率的要点

1.组织培养试剂 优化细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂,并经可能减少所用试剂的变更。 基础培养基—目前所使用的各种市售培养基(如,RPMI 1640和DMEM)。培养基的成分包括营养物质(氨基酸,葡萄糖),维生素,无机盐,和缓冲物质。有些成分非常不稳定,因此如果不在使用时新鲜加入就可能会产生问题。务必要使培养基避光保存。因为已知有一些组分和缓冲物 …

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细胞RNA转染实验注意事项

1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过 …

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siRNA转染效率低的原因有哪些?

1. RNA与转染试剂比例不佳    由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳    调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这 …

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如何选择稳定转染的筛选抗生素?

稳定转染和瞬时转染,细胞转染的步骤基本相同,只是在转染后的细胞处理会不一样。由于瞬时转染只能维持几天,故在转染12~72后就可以在蛋白或基因水平进行相应的检测了。稳转细胞系通常需要通过一些选择性标记反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。 通常构建的载体上有两个抗性基因,如,氨苄青霉素和新霉素。那么建立稳转细胞系时该用哪种抗生素来筛细胞呢? 很多真核表达质粒上都 …

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siRNA细胞转染效率低下的原因

1. RNA与转染试剂比例不佳    由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳    调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这 …

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siRNA转染后细胞出现死亡是什么原因?

       siRNA转染后细胞死亡,原因也是多样的,如脂质体毒性,转染浓度过高,转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生,这种情况下就需要适当优化转染条件;可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂,如Entranster试剂,另外,如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的,出现细胞死亡 …

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通过乳酸脱氢酶法分析细胞活力

图1 乳酸脱氢酶催化的可逆反应 常用的细胞毒性测定方法的基础是测量受损细胞释放的胞浆酶的活性。乳酸脱氢酶( LDH ) 是一种所有细胞中均存在的稳定的胞浆酶。在不同类型的组织中存在5 种不同的乳酸脱氢酶异构体,它们在数量、特异性和酶作用动力学方面存在差异。但所有不同的酶异构体均催化相同的丙酮酸和乳酸相互转化,伴随着NADH 氧化为NAD+的反应(图1) 。当 …

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影响RNA转染实验的因素有哪些?

1.   转染试剂 转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的,而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染,因RNA与DNA大小不同,转染条件不同,所需的试剂也应不同,所以RNA专用的转染试剂会更好一些。比如Entranster-R4000. 2.  RNA转染时RNA的用量 RNA转染的用量必须参考RNA转染试 …

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流式检测细胞周期实验步骤

1. 细胞培养: 取对数生长期的细胞,按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内,进行所需的处理(比如加入药物),特定时间后终止培养,进行下一步的实验。 2. 细胞固定: 800rpm离心5min,收集细胞沉淀,弃上清,用预冷PBS洗涤两次,加入预冷75%乙醇,于4℃固定4h以上。 3. 细胞染色: 1500rpm离心5min, …

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