分子生物学

本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。 试剂 丙烯酰胺： 双丙烯酰胺（19 : 1, 40%, m/V)过硫酸铵( 10%, m/V) 复性缓冲液（10 X ) 2‘ 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸，用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH …

T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。我们都知道，做基因克隆目的基因连接到载体，使目的基因能够在受体细胞进行稳定遗传。部分朋友是把目的片段先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的，有部分朋友就直接将PCR产物酶切连接到能够将目的基因带入受体细胞进行稳定遗传的载体中。那么进行TA克隆到底是不是多此一 …

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一 …

双脱氧法或酶法利用DNA 聚合酶合成单链DNA 模板的互补拷贝，这一方法最先由F. Sanger 及其合作者发展而来。DNA 聚合酶不能起始DNA 链的合成，而是在复性于“模板“DNA 的引物的3 ‘端上进行链的延伸（图1) 。链的延伸是在引物生长端的3′ 羟基掺入脱氧核糖核苷酸。双脱氧测序法利用了DNA 聚合酶能以2′, …

近些年来，随着PCR 技术的出现，以及DNA 克隆和测序方法的发展，对大量质粒载体和重组子的需求也大大减少。因此，本方案曾一度广泛应用，但已经被更为快速和简便的柱纯化方法代替。在本方案中，通过碱裂解法的放大( Bimboim and Doly 1979 ) ，质粒DNA 可从清亮的细菌裂解物中通过含有溴化乙锭的CsCl 梯度离心来进行纯化。 无论是高拷贝数的 …

下面程序描述了使用修饰染料核苷酸，用同步DNA 切割通过缺口翻译制备荧光DNA，缺口翻译是通过摸索修饰dUTP 和dTP 的荧光素或花青的最佳条件完成的(Keller 1993; Yu et al. 1994; Zhu et al. 1994) 。该方法对用四甲基罗丹明、德克萨斯红、香豆素和bodipy 修饰的核苷酸可能也适用，但染料的类型、接头、核苷酸以及 …

ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例，说一下检测实验步骤。 1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。 注意：Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为: 储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度 …

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。 2. 电泳(Electrophoresis …

降解是蛋白质纯化过程中最害怕发生的事情。 基本规则： 划重点：做关于蛋白质的实验时，手边一定要备一个冰桶，管子从冰箱或者冷冻的状况下取出时马上放到冰上。 1. 必须冷冻离心，因为离心会产热。 2. 了解蛋白质的特性。每一个蛋白质性质差异很大，热会使你的蛋白质变性吗？有二硫键吗？能反复冻融吗？如果你不知道，那假定它不能被冷冻和再解冻是热变性的。 3. 在细胞裂 …