英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1、概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. K …
阅读更多 »大肠杆菌转化实验（热击法）
大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。 1原理： 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 2器材： 旋 …
阅读更多 »cDNA文库构建分为哪些阶段？
cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …
阅读更多 »碱变性法提取质粒DNA
质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭 – 氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理和步骤是一致的．包括以下步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提取过程中使用的去垢剂、盐等。 一、原理 …
阅读更多 »如何提高PCR反应的特异性？
1、巣式pcr（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性 2、递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃，直到退火温度低于Tm 5℃ 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。 3、热启动PCR：抑制 …
阅读更多 »色谱法分离蛋白质
色谱 与DNA 和RNA 一样，蛋白质可以进行常规的分离，或者用色谱法来分离。主要用的色谱法是凝胶过滤、 离子交换层析和亲和层析。 1. 凝胶过滤，基于分子的大小对物质进行分离。 工作原理：固定相中包含有很多的孔，只有较小的分子才可以进入。 填料：葡聚糖（交联右旋糖苷）、Sephacryl （烯丙基葡聚糖和N, N－亚甲双丙烯酰胺 …
阅读更多 »如何进行完美的Western Blot实验
条带清晰就是完美的吗？用图像软件调节明暗，用曝光时间来筛选，这样的结果可靠吗？如果在眼花缭乱的品牌和产品中快速准确地挑选好的实验用品？本视频用简短实用的方法告诉你。 本视频下载链接：https://www.engreen.cn/wp-content/uploads/2020/12/Western-Blot实验.mp4
阅读更多 »抗体的使用以及储存方式
一、什么是抗体 抗体是一些淋巴细胞直接抵抗外来分子所产生的蛋白质，它们是免疫系统的重要组成成分，是实验室的重要工具。 多克隆抗体是用抗原注射动物产生的，针对相同蛋白质的不同抗原决定簇直接产生的各种不同亲和性的多种免疫球蛋白的混合物。 单克隆抗体是在体外制备的，是免疫淋巴瘤细胞与分泌抗体的浆细胞融合后产生的，整个培养只产生一种抗体（常是IgG) ，直接抵抗外来 …
阅读更多 »蛋白质的长期保存——以冻干固体的形式保存
一种按适当配方制造的冻干蛋白质制剂能够在几年内保持稳定，即使是在室温(Carpenter and Chang 1996) ；然而，冻干配方的最佳溶液组成和工艺条件的研制远远超出了典型学术实验室的能力范围。一个主要的困难是大多数实验室中所用的冻干机通常没有控制样品温度的能力，不能达到低水平的残留水（如低于质量的1%~2%），而低水平的残留水是冻干产品长期保存活 …
阅读更多 »为什么荧光原位杂交备受关注？
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 一 …
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