英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
长链dsRNA 的导入能够在小鼠卵母细胞、早期胚胎、胚胎干细胞和胚胎癌细胞( Svoboda et al. 2000; Wianny and Zemicka-Goetz 2000; Billy et al. 2001; Yang et al. 2001)，以及植物、蠕虫、果蝇体内诱导特定和高效的RNA 干扰。但是，早期在哺乳动物体细胞中用长链dsRNA 诱导 …
阅读更多 »重叠延伸PCR实验
重叠延伸PCR实验 重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOEPCR）由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。 实验方法原理: 此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶 …
阅读更多 »质粒DNA细胞转染实验效率影响因素有哪些？
质粒DNA细胞转染实验效率影响因素有以下几方面： 1， 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质 …
阅读更多 »DNA 序列测定——化学(Maxam-Gilbert) 测序法
在Maxam 和Gilbert 发展的DNA 化学测序法(1977, 1980) 中，碱基专一性化学试剂在一种或两种特定核苷酸位置上随机断裂已纯化的3’端或5′ 端标记的DNA, 产生4 套寡聚脱氧核糖核苷酸。因为只有末端标记的DNA 片段才能在测序胶的放射自显影图中显示出来，所以只能观察到含有固定末端的片段，这样就产生了4 列DNA …
阅读更多 »从革兰氏阴性菌（如E.coli）中分离DNA
从细菌中分离DNA 需要依赖SDS 和蛋白酶K 以裂解细胞。高分子质量的DNA 需要剪切（以减少它的黏性，更适合操作），用酚和氯仿提取，再用异丙醇提纯。该方案可以分离到长度为3 0 ~ 80kb 的DNA 。 试剂 乙酸铣( 5mol/L ） 细菌培养基(≥l.5mL) 培养基需要在剧烈振荡中过夜。 氯仿 乙醇(70%, 95%) 异丙醇 氯化钠( 5mol …
阅读更多 »揭秘RNAi，缔造实验神话
用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（1-3）后要立刻抽提蛋白，进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …
阅读更多 »聚丙烯酰胺凝胶的配制
表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液 不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml） 溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50 6% 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10 1.5 mol/L Tris (pH …
阅读更多 »siRNA是从牵牛花过表达发现的吗
siRNA（small interfering RNA, 小干扰RNA）并不是从牵牛花的过表达现象中发现的，而是从研究植物基因沉默和RNA干扰现象中逐步发展起来的。siRNA的发现归功于对基因沉默和RNA干扰机制的研究，尤其是科学家在植物、真菌和线虫等生物中对这些现象的观察和研究。 siRNA发现的关键研究 植物基因沉默：在植物中，科学家观察到特定基因可以在 …
阅读更多 »昼夜节律转录因子BMAL1在生殖内分泌学和生育中的关键作用
脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白1（BMAL1）是昼夜节律振荡的核心成分，参与了许多生理活动。越来越多的证据表明BMAL1在生殖生理学中发挥着重要作用。 2022年3月2日，Yin Jiang 等人在Front Endo-crinol（Lausanne）上发表了一篇题为Critical Roles of the Circadian Transcription Fa …
阅读更多 »如何做好Northern Blot实验？
准备阶段：1.180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。 制胶： 1. 称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入 …
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