在体外转录法制备dsRNA(双链RNA)的过程中,确定mRNA的靶区域是关键的一步。以下是一些常用的方法和步骤,以帮助确定mRNA的靶区域: 1. 目标基因的选择 首先,确定你想要抑制或研究的目标基因。你需要有这个基因的完整序列信息(通常从基因数据库中获得,如NCBI)。 2. 设计siRNA或shRNA序列 设计小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(s …
阅读更多 »cDNA文库构建分为哪些阶段?
cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链,然后除掉mRNA,以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …
阅读更多 »PCR扩增产物出现杂带怎么办?
可能的原因和对应的解决方案如下: 1.引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 2.循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。 3.酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。 4.退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的 pcr 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR …
阅读更多 »如何提高qPCR反应的灵敏度与特异性?
1. 首先确定模板RNA完整性好,无DNA污染。 2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3. 为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。 4. 使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 5. 若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。 6. 设计引物时,避免在引物3’端含有 …
阅读更多 »体外转录法制备dsRNA
该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。 试剂 琼脂糖凝胶( 1 %)复性缓冲液( 10 X)ATP 、CTP 、GTP 、UTP ( 每种100mmol/L )二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)DNA 分子质量标准dNTP 混合液,每种1 …
阅读更多 »利用CRISPR精确编辑过敏原基因
过敏性疾病是一个持续存在的临床挑战,治疗选择有限。因此,找到一种治疗过敏原的方法、改善过敏性疾病的技术尤为重要。 2022年1月17日,美国INDOOR生物技术公司的研究团队在《Frontiersin Allergy》杂志上发表了一篇题为 New Frontiers: Precise Editing ofAllergen Genes Using CRISPR …
阅读更多 »EMSA实验步骤
一、探针的标记 如下设置探针标记的反应体系: (1)待标记探针 (1.75 pmol/μl) :2μl (2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1μl (3)Nuclease-Free Water :5μl (4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1μl (5)T4 P …
阅读更多 »昼夜节律转录因子BMAL1在生殖内分泌学和生育中的关键作用
脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白1(BMAL1)是昼夜节律振荡的核心成分,参与了许多生理活动。越来越多的证据表明BMAL1在生殖生理学中发挥着重要作用。 2022年3月2日,Yin Jiang 等人在Front Endo-crinol(Lausanne)上发表了一篇题为Critical Roles of the Circadian Transcription Fa …
阅读更多 »cDNA文库构建详细步骤
cDNA文库的构建分为六个阶段: 阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成: poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl …
阅读更多 »2022的七大热点技术: 靶向基因治疗、空间多组学……
1.完全基因组 在去年5月发表的预印本中,人类共有基因组序列 GRCh38 添加了近 2 亿个新碱基对,并撰写了人类基因组的最后一章。 GRCh38 于 2013 年首次发布,一直是一个有价值的工具,但也存在漏洞。主要是因为测序技术产生的读数准确但较短。它们的长度不足以明确地绘制出高度重复的基因组序列,包括覆盖染色体末端的端粒和在细胞分裂过程中协调新复制的 …
阅读更多 »