2025年 3 月 18日, 星期二
新闻

核酸基因

mRNA的分离纯化原理

【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子,是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物,因此,高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1×10-5g RNA,理论上认为每克细胞可分离出5~10mg RNA。其中rRNA为75%~ 85%,tRNA占1 …

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聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项

聚丙烯酰胺凝胶必须由丙烯酰胺单体、聚合起始物、催化剂以及合适的盐及缓冲液的混合物聚合起来。 丙烯酰胺与BIS (N, N’ – 亚甲双丙烯酰胺)是形成胶基质的单体。 过硫酸铵启动胶的聚合过程。胶的配方要求10% 以水配制的过硫酸铵溶液。大多数资料显示需要现配现用。但是,10 %溶液可以在4℃放置数周而没有明显的活性丢失。最多配制10 …

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如何将胶内物质转移到膜上?

凝胶是厚而易碎的基质,这使得操作与温浴都很困难。如果要对胶内的内容物进行杂交,必须将内容物从凝胶引导到硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。这一过程称为转移。 转移之后,滤膜与一个探针温浴,观察探针是否能与滤膜上的分子杂交。探针由放射性元素或者其他指示剂标记,所以可以被检测。滤膜与探针的杂交称为印迹。 第一次使用印迹技术是由Southern 描述的, 因此, 这种印迹被 …

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SDS 碱裂解法制备质粒DNA: 大量制备

近些年来,随着PCR 技术的出现,以及DNA 克隆和测序方法的发展,对大量质粒载体和重组子的需求也大大减少。因此,本方案曾一度广泛应用,但已经被更为快速和简便的柱纯化方法代替。在本方案中,通过碱裂解法的放大( Bimboim and Doly 1979 ) ,质粒DNA 可从清亮的细菌裂解物中通过含有溴化乙锭的CsCl 梯度离心来进行纯化。 无论是高拷贝数的 …

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慢病毒感染细胞后,细胞长满48小时是否可以先传代,再等到72小时再喷霉素筛选吗

通常在进行慢病毒感染后,建议遵循以下操作步骤: 感染后观察细胞状态:感染后一般在48-72小时内可以看到较为明显的表达,但是否开始筛选需要看细胞的状态和感染效率。如果细胞长满了,可以考虑先进行传代,以避免细胞过度拥挤影响生长和感染效果。 喷霉素筛选的时机:喷霉素通常在感染后48-72小时开始筛选,但实际开始筛选的时间取决于感染效率和细胞状态。如果细胞感染后状 …

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测序胶的灌制、电泳及处理

推荐用6 %丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶:一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息;另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程,采用6 %丙烯酰胺,可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶,使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。 材料 盛于喷射洗瓶的 …

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做电泳实验必须要知道的基础知识

*样品制备 样品必须完全溶解于上样缓冲液,否则不能在凝胶中移动。样品太浓可能产生假相。 样品缓冲液包含盐类(维持样品)、甘油(增加重量从而使样品下沉至点样孔)、以及示踪染料(以便监测电泳进程)。 样品缓冲液可以分装成小部分冻存。 缓冲液加到凝胶上之后才能点样。 样品缓冲液中的示踪染料可以指示什么时候终止电泳。两种最常用的染料是漠酚蓝(BPB) 与二甲基苯青F …

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siRNA表达载体的构建成功要点

对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列 为了找到潜在靶位点,扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析,去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能,siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。 选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 在转染前要确认 …

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RNA沉淀方法

乙醇沉淀RNA通常RNA 可以像DNA 一样沉淀。步骤1. 加入1/10 体积1 mol/L 的NaOAc (pH4. 8) 和2.5 倍体积冷的95 %的乙醇。2.-20 ℃ 下沉淀过夜。3. 用70 %的乙醇洗涤沉淀。注意:当你处理少量RNA 的时候(低于5 μg) ,在RNA 沉淀之前加入一些载体或者共沉淀物,这类物质将帮助沉淀RNA, 更容易看见沉淀 …

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微型凝胶电泳后使用溴化乙锭(EB)估算条带中DNA 数量

此方案概述了一个快速定量DNA 的方法,并同时分析其物理状态。溴化乙锭染色后,用UV 灯照射透视法可以发现包含>5ngDNA 的DNA 条带。CCD 照相机拍下未知样品的影像,然后与一系列已知含量标准品进行强度(灰度)对比,从而估计未知样品中DNA的含量。染色凝胶分析是一种快速的同时测量DNA 的数量并分析其物理状态的方式。 SYBR 染料也可用于染色并大致 …

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