质粒DNA细胞转染实验效率影响因素有以下几方面: 1, 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果:超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多,特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟,相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质 …
阅读更多 »cDNA文库构建分为哪些阶段?
cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链,然后除掉mRNA,以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …
阅读更多 »Trizol法提取总RNA的原理及注意事项
原理:Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能析出有机层的 …
阅读更多 »逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
一、原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的 …
阅读更多 »南京中医药大学:忍冬苷靶向EZH2减轻溃疡性结肠炎通过自噬介导NLRP3炎性体失活
结肠巨噬细胞内NLRP3炎症小体的异常激活与溃疡性结肠炎的发生发展密切相关。虽然靶向NLRP3炎症小体被认为是一种潜在的治疗方法,但其调节肠道炎症的潜在机制仍存在争议。 2021年3月9日,发表于Acta Pharmaceutica Sinica B(影响因子11.413)的一篇题为Lonicerin targets EZH2 toalleviate ulc …
阅读更多 »重叠延伸PCR实验
重叠延伸PCR实验 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。 实验方法原理: 此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶 …
阅读更多 »RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系
RNA干扰 (RNAi):近年来的研究表明,将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发生特异性的降解,导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰(RNAi)。 MicroRNA(miRNA,微RNA): …
阅读更多 »如何提高PCR反应的特异性?
1、巣式pcr(Nest-PCR)可增加稀有靶序列的灵敏度;降低了扩增多个靶位点的可能性;提高PCR特异性 2、递减PCR(Touch Down PCR):前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性;循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始,然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃ 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。 3、热启动PCR:抑制 …
阅读更多 »双脱氧法DNA 测序常见问题
问题 可能原因 解决方法 放射自显影片空白 DNA 聚合酶失活 标记物太旧 用对照引物、模板及试剂进行试验 试剂太旧 替换缺陷试剂 不正确或有缺陷的引物 不正确或有缺陷的模板, 曝光失误(如保留了保鲜膜,凝胶对着胶片的背面等 改正错误 整张放射自显影片太亮/标记物掺入不足 标记物太旧 采用新标记物 酶活性太低 采用 …
阅读更多 »寡聚(dT)-纤维素柱层析法分离纯化mRNA
【试剂与器材】 (一)试剂 1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL 2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素 3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(p …
阅读更多 »