[实验原理] 当细胞置于非常高的电场中,细胞膜就变得具有通透性,能让外界的分子扩散进细胞内,这一现象称为电穿孔。运用这一技术,许多物质,包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法,电穿孔已被广泛用于各种细胞类型,包括细菌、酵母、植物和动物细胞;而且,它还能作为注射方法(称为电注射),把各种外源物质引入活细胞。与其他常用 …
阅读更多 »碱变性法提取质粒DNA
质粒DNA提取的方法很多,有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭 – 氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种,但基本原理和步骤是一致的.包括以下步骤:(1)裂解菌体细胞;(2)质粒和染色体DNA的分离;(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分;(4)除去提取过程中使用的去垢剂、盐等。 一、原理 …
阅读更多 »体外转录法制备dsRNA
该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。 试剂 琼脂糖凝胶( 1 %)复性缓冲液( 10 X)ATP 、CTP 、GTP 、UTP ( 每种100mmol/L )二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)DNA 分子质量标准dNTP 混合液,每种1 …
阅读更多 »cDNA文库构建详细步骤
cDNA文库的构建分为六个阶段: 阶段1:反转录酶催化合成cDNA第一链 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成: poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl …
阅读更多 »RNA 定量-紫外(UV) 分光光度法
在进行大多数RNA 分析之前, RNA 定量是一种重要和必需的步骤。RNA 定量方法可以分为两类:紫外(UV) 分光光度法,此方法基于嘌呤和嘧啶碱基的吸收光谱; 基于荧光染料的方法,结合到核酸时选择性发荧光,测定荧光染料的强度。如果RNA 样品是纯的( 如没有诸如蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染),用UV 分光光度法测量被碱基吸收的UV 射线简单而且精确。 …
阅读更多 »无菌操作的注意事项及常见问题
做不同的实验,操作上会有小小的不同,而且不可能每个动作都被描述,所以实验时必须注意自己的动作。通常要注意的就是每项操作时都要尽可能减少污染的可能性,所以动作要尽量减少。 距离,尽量将所需要的物品放在离手最近的地方。距离越近,移动就越少。 暴露,在空气中移动物品的时间越长,接触空气中微粒的概率则越大。试剂瓶敞口在空气中的时间越长,掉落进去的空气中的微粒越多。灼 …
阅读更多 »寡聚(dT)-纤维素柱层析法分离纯化mRNA
【试剂与器材】 (一)试剂 1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL 2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素 3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(p …
阅读更多 »DNA的乙醇沉淀
沉淀DNA 样品能达到浓缩的目的,而且沉淀也会去除阻止许多酶反应的残留氯仿。 一、步骤 于最多体积450 μl 的DNA 样品中,加入1/10体积pH4.2的3 mol/L NaAc, 快速颠倒以混匀。 加入2倍体积95%乙醇或无水乙醇,充分混匀。 样品踩于冷环境中沉淀:-20℃ 过夜,或-70℃30 min, 或干冰中5 min 。 使用干冰进行乙醇沉淀 …
阅读更多 »异丙醇法沉淀DNA
DNA 在含有异丙醇的溶液中比在含有乙醇的溶液中难溶。乙醇沉淀法需要2 ~ 3 倍体积的乙醇,异丙醇沉淀则需要0.6 ~ 0.7 倍的体积。沉淀大体积溶液中的DNA 时,异丙醇是比较好的选择。在室温用异丙醇沉淀减少了一些蔗糖或者氯化钠和DNA 发生共沉淀的现象。但异丙醇还是有一些不足之处: 盐在35 %的异丙醇溶液中比在65 %的乙醇溶液中难溶。 DNA 沉 …
阅读更多 »实验室最常用的移液枪你用对了吗?
移液枪对我们医药生物研究人员来说是最熟悉不过了。可是,你真正了解它吗?你的使用方式是正确的吗?相信不少人听到这个问题后,已经开始回想自己平时的操作,也有一部分人在认真考虑答案了吧。细节决定成败,今天在这里跟大家普及一下移液枪的使用规程,希望对大家以后的实验有帮助。 一、移液枪的使用规程 1. 移液枪的放置 移液枪要放在支架上 2. 样品准备 要求液体温度与吸 …
阅读更多 »