推荐用6 %丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶:一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息;另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程,采用6 %丙烯酰胺,可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶,使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。 材料 盛于喷射洗瓶的 …
阅读更多 »DNA分离前你应该知道的那些事
DNA 是相当稳定的。这也是保存和传递遗传信息所必须具备的但是不能因此而太随意,DNA的污染来源主要是其他DNA 。 DNA 分离 分离的DNA可以是基因组的也可以是染色体组外的。 研究DNA 分离试剂盒,这些试剂盒可以是针对基因组的和染色体组外的DNA、从琼脂糖凝胶中分离DNA或者从PCR产物中抽提DNA。他们利用一些结合DNA的树脂或者滤膜,通常是一些小 …
阅读更多 »采用dsRNA 浸泡果蝇S2 细胞进行RNA 干扰
该方案是一种通过用含有dsRNA 的培养液浸泡果蝇S2 细胞来诱导RNA 干扰的简便方法。与转染方法相比,浸泡操作需要的步骤更少,因此可用于高通量的RNA 干扰筛选。而且, 浸泡避免了转染试剂可能带来的毒性,但是,通过浸泡向果蝇S2 细胞转运dsRNA 的效率与转染方法相比较低。对于通过浸泡dsRNA 难以抑制其表达的基因,可以通过多次转染dsRNA 获得抑 …
阅读更多 »DNA 样品的酚抽提
酚抽提通常用来对DNA 或RNA 样品进行蛋白质的去除。酚与水不互溶,当它们混合时会形成两相,水相和酚相。当含有DNA 的水溶液与酚混合时,蛋白质会进入酚相,再将含DNA 的水相取出进行再抽提和乙醇沉淀浓缩。 一、材料 抗有机溶剂的塑料管,尝试尽可能小的体积,大多数的抽提可以在微量离心管中进行。 TE 饱和的酚:氯仿:异戊醇(25 : 24:1) 氯仿:异戊 …
阅读更多 »shRNA转染后,什么时候做RT-PCR最好?
shRNA转染后,进行RT-PCR的最佳时间取决于多种因素,包括细胞类型、转染效率、shRNA的表达和目标基因的降解速度。一般来说,在转染后的24到72小时内进行RT-PCR是比较常见的时间点。具体来说: 24小时后:在这个时间点,可以开始检测到shRNA的表达以及目标基因的初步下调情况。对于一些高效的shRNA,这个时间点可能已经有显著的基因沉默效果。 4 …
阅读更多 »无菌操作的注意事项及常见问题
做不同的实验,操作上会有小小的不同,而且不可能每个动作都被描述,所以实验时必须注意自己的动作。通常要注意的就是每项操作时都要尽可能减少污染的可能性,所以动作要尽量减少。 距离,尽量将所需要的物品放在离手最近的地方。距离越近,移动就越少。 暴露,在空气中移动物品的时间越长,接触空气中微粒的概率则越大。试剂瓶敞口在空气中的时间越长,掉落进去的空气中的微粒越多。灼 …
阅读更多 »慢病毒感染后72小时,效率低,细胞已经长满,有什么办法补救?
在慢病毒感染后72小时感染效率较低、细胞已经长满的情况下,可以尝试以下几个措施来提高感染效率并优化实验条件: 细胞传代或重新播种:如果细胞已经长满(汇合度较高),可能会影响慢病毒的感染效率。可以将细胞进行传代,重新播种在新的培养板上,使其达到较低的汇合度(例如30-50%),然后再进行感染。 优化感染时的MOI(Multiplicity of Infecti …
阅读更多 »siRNA,shRNA,dsRNA,miRNA间的区别
RNA干扰(RNAi),即用20多个核苷 酸组成的短的双链RNA(siRNA)代替传统反义核酸进行转录后基因沉默,已经迅速而广泛地应用到基因功能,基因表达调控机制研究等热门领域,并为基因 治疗开辟了新的途径。近两年来,这方面的科学论文及报道爆炸性增长,几乎每天都有新的结果涌现。这些论文中,出现了很多与RNA干扰相关的概念,意思很相 近但并不完全相同,这里列举 …
阅读更多 »丁醇抽提法浓缩核酸
用仲丁醇( 2 -丁醇)或正丁醇( 1 - 丁醇)等溶剂萃取水溶液时,部分水分子会进入有机相,而核酸依然留在水相。重复抽提几次后可显著减少核酸溶液的体积。这一浓缩方法可用于减少稀溶液的体积,以使核酸易于通过乙醇沉淀得到回收。 试剂 DNA 样品 异丁醇 方法 计算核酸溶液体积,在2 5 °C 下加入等量的异丙醇。轻微、充分混匀两相。 加入过多的异丙醇 …
阅读更多 »实时荧光定量PCR为什么倍受青睐?
一、 实时荧光定量PCR技术是一种新型的科学定量方法,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。 二、 目前,荧光定量PCR所使 …
阅读更多 »