使用高纯度、无菌的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。建议在250-750nM最终浓度范围内的进行siRNA不同浓度的梯度实验。建议设置一个非靶向或无意义的siRNA对照序列,以验证实验siRNA的特异性。同时也验证,针对单个基因用多个siRNA序列实验产生的表型是否是由于脱靶 …
阅读更多 »细胞电转染实验效率不理想的原因
1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期 …
阅读更多 »细胞电转染实验效率低的原因是什么?
细胞电转染实验效率低的原因一般有以下几点: 1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d …
阅读更多 »电转染实验,如何设置正确的siRNA实验对照组?
1.设置空白对照组,检验细胞生长状态。 2.设置阴性对照组,无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂 + 阴性siRNA。 3.设置阳性对照组,无血清培养基 + Entranster-E 电转染试剂+ 靶向siRNA 转染管家基因,比如GAPDH 或者 Lamin A/C,之后通过western blotting 或者 mRNA quantif …
阅读更多 »电穿孔转化感受态E.coli TG1细胞的制备
一、材料和试剂 恒温旋转式摇床 三角烧瓶(容量为1或2L) 50ml灭菌离心管 低温高速离心机 SB培养基 细菌培养用胰化蛋白胨 20g 细菌培养用酵母提取物 5g NaCl 0.5g 去离子水 950ml 250mmol/L KCl溶液 10ml 以5N …
阅读更多 »电转染后细胞孵育时间是多少?
每种细胞类型电转染后有最佳孵育时间。对于质粒的电转染,最佳孵育时间一般为12-48小时,具体最佳时间需根据实验目的、质粒性质和表达蛋白的半衰期进行调整。 如需了解更多关于电转染试剂的信息,请点击https://www.engreen.com.cn/efficient-electroporation
阅读更多 »Jurkat E6-1细胞的电转染条件是什么?
使用Entranster-E电转液与指数衰减脉冲电转仪时Jurkat E6-1细胞的电转染条件是: 对于0.2 cm电转杯,细胞密度为10×10^6 cells/ml,DNA用量为2μg,电转液体积为100μl,电压为150V, 电容为950μF。 对于0.4 cm电转杯,细胞密度为10×10^6 cells/ml,DNA用量为5μg,电 …
阅读更多 »电转效率受哪些因素影响?
电穿孔效率受以下几种因素的影响: 外加电场的强度。电压过低,培养细胞质膜的改变不足以允许DNA 通过; 电压过高,细胞会受到不可逆的损伤。对于大多数哺乳动物细胞系, 电压250~ 500V/cm时可达到最高瞬时表达水平。通常经过电穿孔, 20% ~ 50%的细胞能够存活(根据台盼蓝拒染法的检测结果) ( Patterson 1979; Baum et al. …
阅读更多 »细胞电转染实验注意事项
选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 细胞的选择 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛,表面结构致密比稳定 …
阅读更多 »电转染实验过程影响因素
1 电场参数 电场是电转染的重要因素,细胞在电场的作用下,膜通透性增加或是形成小孔,以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此,一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值,其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外,还可以 …
阅读更多 »