分子生物学

在亲和层析纯化抗体后，通常需要添加稳定剂以保护抗体免受降解。常见的稳定剂包括甘油、糖类（如蔗糖或海藻糖）、以及醇类（如乙醇）。添加这些稳定剂的目的是增加抗体的稳定性，特别是在长期保存或反复冻融过程中。以下是常用稳定剂的添加浓度建议： 1. 甘油 (Glycerol) 甘油常用于抗体溶液的冷冻保存，以防止冰晶形成和蛋白质变性。推荐添加浓度为： 最终浓度：10- …

用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（1-3）后要立刻抽提蛋白，进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …

原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的 …

实验原理  在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于构建基因组文库和 Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。 仪器、材料与试剂 (一)仪器 1 . 台式离心机 2 …

1． Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效） 2． 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris—base 4 …

SDS-PAGE原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 不同蛋白质具有不同的等电点，在进 …

聚丙烯酰胺凝胶必须由丙烯酰胺单体、聚合起始物、催化剂以及合适的盐及缓冲液的混合物聚合起来。 丙烯酰胺与BIS (N, N’ – 亚甲双丙烯酰胺）是形成胶基质的单体。 过硫酸铵启动胶的聚合过程。胶的配方要求10% 以水配制的过硫酸铵溶液。大多数资料显示需要现配现用。但是，10 ％溶液可以在4℃放置数周而没有明显的活性丢失。最多配制10 …

     做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现，要弄清楚“背景太高”的原因，先要知道“背景”是什么，“背景”也是发光，影响发光的因素就会影响背景。     影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝 …

T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。我们都知道，做基因克隆目的基因连接到载体，使目的基因能够在受体细胞进行稳定遗传。部分朋友是把目的片段先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的，有部分朋友就直接将PCR产物酶切连接到能够将目的基因带入受体细胞进行稳定遗传的载体中。那么进行TA克隆到底是不是多此一 …

分子信标(molecular beacon)是一种具有发夹结构的新型荧光标记核酸探针，具有高灵敏度、高特异型，其在聚合酶链反应（PCR）、核酸序列的分析、活细胞内核酸的动态检测、蛋白质(酶)与核酸的相互作用等方面具有广泛的应用。 分子信标的结构 分子信标的结构一般包括三个部分：环状区、信标茎干区、荧光基团和猝灭基团。荧光基团一般联接在信标分子的5 端；猝灭基 …