利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA
分子克隆最基础的操作可能就是核酸纯化了。去除蛋白质的关键步骤经常是简单地利用酚:氯仿和氯仿把DNA 从水相中萃取出来。这种萃取可在进行一步法克隆操作前有效灭活和去除蛋白酶。然而,如果是从复杂分子混合物如细胞裂解液中纯化DNA 时,则需要更多的检测。在这些情况下, 一般是在用有机溶剂萃取前,利用蛋白质水解酶如链霉菌蛋白酶或蛋白酶K (表1 ) 去除大部分蛋白质 …
阅读更多 »PCR (多聚酶链式反应)
PCR 是1985 年由Kary Mulis 在Cetus 公司发明的,是一种体外复制和扩增DNA的方法。 DNA模板首先在高温下变性,当温度降低时,DNA 两侧的寡核苷酸引物与互补序列结合,在DNA聚合酶作用下,随着温度的缓慢提升,引物逐渐延伸,两条引物之间的区域被合成。然后DNA再次变性,引物再次结合,DNA的合成再次进行,这样周而复始,重复20 …
阅读更多 »SDS-PAGE的主要应用有哪些?
SDS-PAGE原理 蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 不同蛋白质具有不同的等电点,在进 …
阅读更多 »2022的七大热点技术: 靶向基因治疗、空间多组学……
1.完全基因组 在去年5月发表的预印本中,人类共有基因组序列 GRCh38 添加了近 2 亿个新碱基对,并撰写了人类基因组的最后一章。 GRCh38 于 2013 年首次发布,一直是一个有价值的工具,但也存在漏洞。主要是因为测序技术产生的读数准确但较短。它们的长度不足以明确地绘制出高度重复的基因组序列,包括覆盖染色体末端的端粒和在细胞分裂过程中协调新复制的 …
阅读更多 »从革兰氏阴性菌(如E.coli)中分离DNA
从细菌中分离DNA 需要依赖SDS 和蛋白酶K 以裂解细胞。高分子质量的DNA 需要剪切(以减少它的黏性,更适合操作),用酚和氯仿提取,再用异丙醇提纯。该方案可以分离到长度为3 0 ~ 80kb 的DNA 。 试剂 乙酸铣( 5mol/L ) 细菌培养基(≥l.5mL) 培养基需要在剧烈振荡中过夜。 氯仿 乙醇(70%, 95%) 异丙醇 氯化钠( 5mol …
阅读更多 »Western-Blot中BSA,脱脂蛋白的作用是什么?
经常有人做Western-Blot会疑惑:为什么做蛋白实验,应该把杂蛋白去除才对,会担心其他蛋白的加入会影响实验结果,增加背景。但为什么偏偏会用加入BSA,脱脂蛋白的方法减少背景呢? 这需要从Western-Blot的原理说起,Western-Blot中电泳转膜后让蛋白分布NC膜或PVDF膜上,但膜上还有很多地方是空白的,这些空白的地方如果不被封闭,很可能就 …
阅读更多 »小RNA 的Northern 杂交分析
该方案描述如何运用Northern 杂交检测15~150 个核昔酸的小RNA (图1) 。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总RNA, 再采用半干法进行转膜。RNA 通过紫外线照射交联至尼龙膜上,在Church 缓冲液中对RNA 和α-32p标记的寡核昔酸探针进行杂交,并用磷酸成像分析技术(phosphorimager analysis) 进行检测分析。使用包含两个 …
阅读更多 »亲和层析纯化抗体,如何减少洗脱后中和沉淀的出现?
随着亲和层析技术的发展,蛋白纯化技术相对简单,蛋白纯化技术的应用也越来越普遍,一步亲和层析即可达到90%以上的纯度。然而,蛋白纯化的过程中各个环节不容忽视。样品处理,纯化介质的选择,纯化方法的考虑,等等,虽然纯化方法简单,但是蛋白不同,采用的纯化体系也不尽相同。只要达到最终的纯化目的就是最好的纯化方法。 对于亲和层析纯化抗体,不论是蛋白A/G还是特异性抗原亲 …
阅读更多 »如何制备双链siRNA?
本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。 试剂 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺(19 : 1, 40%, m/V)过硫酸铵( 10%, m/V) 复性缓冲液(10 X ) 2‘ 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸,用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH …
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