英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
常见问题 …
阅读更多 »Western-blot化学发光(ECL)时，胶片上条带很弱是什么原因？
条带弱的原因可能有以下几个方面： ①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整，如英格恩的Enlight-plus。 ②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。 ③. 抗体效价 …
阅读更多 »western-blot化学发光（ECL）时，胶片上条带很浓怎么办？
可通过以下几个方面进行改进： 1. 可减少蛋白上样量； 2. 降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间； 3. 如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。 4.选择合适的发光液，比如Enlight。
阅读更多 »SDS-PAGE蛋白质样品的制备
将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20℃保存备用。 SDS-PAGE蛋白质电泳 1）按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。 2）分离胶的制备 按下列成分配制10mL 12%分离胶： ddH2O 30%丙烯酰胺混合液 1.5M Tris …
阅读更多 »2024诺贝尔化学奖之蛋白质结构预测
蛋白质结构预测（Protein Structure Prediction）是一项利用计算方法预测蛋白质分子的三维结构的技术。由于蛋白质的功能很大程度上依赖于其三维结构，预测其结构对理解生物过程、药物设计等领域具有重要意义。然而，实验确定蛋白质结构（如X射线晶体学、核磁共振等方法）耗时费力，因此计算预测成为重要替代方法。 蛋白质结构预测的主要方法 同源建模（H …
阅读更多 »SDS-PAGE的主要应用有哪些？
SDS-PAGE原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 不同蛋白质具有不同的等电点，在进 …
阅读更多 »如何对包涵体蛋白进行表达与复性
包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的 …
阅读更多 »建立透析的方法步骤
1. 剪下一段足够装得下要透析物质的透析袋，在每个末端留下大概2 英寸（总共留下4英寸）来捆绑透析袋。（可以买到特殊的管子来进行微量的透析。）2. 透析袋的两端都要打结，或者用透析夹封住末端。3. 用戴手套的手打开透析袋的一个末端，另一个手拿住透析袋，把样品认真地装入透析袋中。4. 扎住或者夹住透析袋的末端，夹住之前先挤压赶走气泡，检查渗漏，尤其注意末端。5 …
阅读更多 »western-blot化学发光为什么会出现高背景？
做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现，要弄清楚“背景太高”的原因，先要知道“背景”是什么，“背景”也是发光，影响发光的因素就会影响背景。 影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝 …
阅读更多 »离心的种类和原理
离心方法主要有两种：制备型（用来分离某些颗粒）和分析型（用来了解分离颗粒的物理性质）。 分子或细胞生物学实验室中所作的决大多数离心机属于制备型离心机，而多数常规制备型离心是差速离心。 g 力和每分钟旋转次数(rpm) 是大略的值：取决于所用的离心机型号和转子。 差速离心（沉淀） 原理：样品在一定速度下离心，分成上清部分与沉淀部分。样品根据沉降速度不同得到分离 …
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