英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
在Western Blot实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差。所以一般的Western Blot实验都需要进行内参设置。 内参即是内部参照(Internal Control)，Western Blot实验中选择内参作为参照体系对于实验结果的分析具有很好的说明性。对于哺乳动物细胞表达来说，内参一般是指由管家 …
阅读更多 »WB内参的重要性
2024诺贝尔化学奖得主David Baker和他的Rosetta模型
Rosetta模型是一套用于蛋白质结构预测、分子对接和设计的计算工具集，由2024年诺贝尔化学奖得主，华盛顿大学David Baker教授的实验室开发。Rosetta最初被设计用于蛋白质结构预测，但如今已发展成一套多功能的平台，被广泛应用于蛋白质折叠、蛋白质-蛋白质和蛋白质-小分子相互作用、以及新蛋白质设计等领域。 Rosetta模型的核心功能 1.蛋白质 …
阅读更多 »蛋白质凝胶电泳注意事项
大多数蛋白质凝胶电泳是还原性条件下的十二烧基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE) 。 ＊样品准备 还原试剂2－巯基乙醇或者二硫苏糖醇加在变性胶的样品缓冲液中，还原蛋白质中的二硫键，确保蛋白质维持在测定分子量所需的无规则卷曲状态。 样品缓冲液分成小管，贮于－20℃ 。甘油浓度很高，足以防止样品冻结，所以不必担心冻融所造成的损伤。当管中没有还原试剂的味 …
阅读更多 »蛋白质浓度的测定
通常用的蛋白质浓度测定方法是Bradford 、BCA 以及在280 nm 处的光吸收。实验室倾向于选择一些特定的方法，在订购新的试剂前先试用实验室的常规方法。Brad ford法是最好的一种可以用来满足所有目的的方法。 不能直接用一种方法的结果与另一种方法进行比较，必须相对浓度来比较，例如，用Bradford 法测量到的牛血清清蛋白的量比其称量的值高两倍。 …
阅读更多 »western-blot化学发光（ECL）的特异性差怎么办
特异性差，出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20 …
阅读更多 »单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系
在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。 附加材料 生长的杂交瘤 克隆和扩增用培养基 24 孔板 4ml 有盖试管，无菌 步骤 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 ％汇合时（主 …
阅读更多 »蛋白质的保存方法如何选择？
保存方法的选择取决于几个因素，包括蛋白质内在的稳定性、所需的保存时间的长短和对于防止破坏所要求的程度。这些因素有很大的变异性，但是，在大多数情况下都应当遵守以下常规的准则。 如果仅仅是要将小批量的纯化蛋白质保存约几天的时间，那么通常只要以非冷冻的溶液形式4°C保存即可，如果需要保存较长的时间，或如果有明显的蛋白质降解（如可见的沉淀物或不可接受的功能损失），那 …
阅读更多 »western-blot实验常见问题及解决方案（enlight）
western-blot化学发光（ECL）的特异性差是什么原因？
特异性差，出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20 …
阅读更多 »western-blot实验步骤
Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。 2. 电泳(Electrophoresis …
阅读更多 »