推荐用6 %丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶:一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息;另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程,采用6 %丙烯酰胺,可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶,使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。 材料 盛于喷射洗瓶的 …
阅读更多 »EMSA实验步骤
一、探针的标记 如下设置探针标记的反应体系: (1)待标记探针 (1.75 pmol/μl) :2μl (2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1μl (3)Nuclease-Free Water :5μl (4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1μl (5)T4 P …
阅读更多 »PCR、RT-PCR、qRT-PCR实验精髓
PCR PCR是很多科研者进入实验室做的第一个分子实验,名字听起来很高级,其实操作起来流程还是比较清晰明了,容易上手。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,用于放大特定的DNA片段,也可看作生物体外的特殊DNA复制。其中使用的Taq酶是1976年从温泉中的细菌分离出来的。它的特性在于能耐高温,是一个很理想的酶。PC …
阅读更多 »做电泳实验必须要知道的基础知识
*样品制备 样品必须完全溶解于上样缓冲液,否则不能在凝胶中移动。样品太浓可能产生假相。 样品缓冲液包含盐类(维持样品)、甘油(增加重量从而使样品下沉至点样孔)、以及示踪染料(以便监测电泳进程)。 样品缓冲液可以分装成小部分冻存。 缓冲液加到凝胶上之后才能点样。 样品缓冲液中的示踪染料可以指示什么时候终止电泳。两种最常用的染料是漠酚蓝(BPB) 与二甲基苯青F …
阅读更多 »如何将胶内物质转移到膜上?
凝胶是厚而易碎的基质,这使得操作与温浴都很困难。如果要对胶内的内容物进行杂交,必须将内容物从凝胶引导到硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。这一过程称为转移。 转移之后,滤膜与一个探针温浴,观察探针是否能与滤膜上的分子杂交。探针由放射性元素或者其他指示剂标记,所以可以被检测。滤膜与探针的杂交称为印迹。 第一次使用印迹技术是由Southern 描述的, 因此, 这种印迹被 …
阅读更多 »实验室最常用的移液枪你用对了吗?
移液枪对我们医药生物研究人员来说是最熟悉不过了。可是,你真正了解它吗?你的使用方式是正确的吗?相信不少人听到这个问题后,已经开始回想自己平时的操作,也有一部分人在认真考虑答案了吧。细节决定成败,今天在这里跟大家普及一下移液枪的使用规程,希望对大家以后的实验有帮助。 一、移液枪的使用规程 1. 移液枪的放置 移液枪要放在支架上 2. 样品准备 要求液体温度与吸 …
阅读更多 »DNA 样品的酚抽提
酚抽提通常用来对DNA 或RNA 样品进行蛋白质的去除。酚与水不互溶,当它们混合时会形成两相,水相和酚相。当含有DNA 的水溶液与酚混合时,蛋白质会进入酚相,再将含DNA 的水相取出进行再抽提和乙醇沉淀浓缩。 一、材料 抗有机溶剂的塑料管,尝试尽可能小的体积,大多数的抽提可以在微量离心管中进行。 TE 饱和的酚:氯仿:异戊醇(25 : 24:1) 氯仿:异戊 …
阅读更多 »构建小RNA 高通量测序文库
小RNA 克隆和高通量测序的结合是纯化和鉴别细胞或组织中小RNA 的有效先进技术。本方案描述了用于Illumina Genome Analyzer 高通量分析的19 ~ 29 个核苷酸小RNA 的克隆方法,通过聚丙烯酰胺凝胶从总RNA 样品中分离纯化小RNA, 并进行两步连接反应:小RNA3′ 端与5′ 腺苷酸DNA 连接物的连接;以 …
阅读更多 »shRNA转染后,什么时候做RT-PCR最好?
shRNA转染后,进行RT-PCR的最佳时间取决于多种因素,包括细胞类型、转染效率、shRNA的表达和目标基因的降解速度。一般来说,在转染后的24到72小时内进行RT-PCR是比较常见的时间点。具体来说: 24小时后:在这个时间点,可以开始检测到shRNA的表达以及目标基因的初步下调情况。对于一些高效的shRNA,这个时间点可能已经有显著的基因沉默效果。 4 …
阅读更多 »寡聚(dT)-纤维素柱层析法分离纯化mRNA
【试剂与器材】 (一)试剂 1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL 2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素 3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(p …
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