一、Real-time qPCR定量方法 可以分为绝对定量和相对定量。 绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线,在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较,从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ssDNA。 相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值 …
阅读更多 »如何制备双链siRNA?
本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。 试剂 丙烯酰胺: 双丙烯酰胺(19 : 1, 40%, m/V)过硫酸铵( 10%, m/V) 复性缓冲液(10 X ) 2‘ 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸,用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH …
阅读更多 »师姐真传的一些引物设计技巧(师姐比师兄靠谱)
实验室小白遇上引物设计,一片迷茫,不知所措。 师姐:现在常用的的引物设计软件有Oligo、PrimerPremier、DNA man等等,还有在线引物设计软件。咱实验室的软件给你拿去。 (师姐比师兄靠谱,真的是手把手的教了,边操作边讲解。) 1. 在NCBI上搜索到该基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin中 …
阅读更多 »mRNA的分离
mRNA 在细胞总RNA 中占较小的比例,大量的是核糖体RNA。真核生物的mRNA分离方法利用了大多数mRNA 存在多聚腺苷酸尾巴(有一些mRNA 没有多聚腺苷酸的尾巴)。Poly(A) RNA 可以结合在有多聚寡核苷酸(dT) 的树脂上,在高盐的条件下寡聚胸苷酸-纤维素可以结合PolgA-mRNA, 在低盐的情况下洗脱。这种方法可以批量或者在一个小柱子上操 …
阅读更多 »siRNA表达载体的构建
siRNA表达载体构建可以:(1)作为后基因组时代基因功能分析的有力工具;(2)应用于基因组学、细胞信号传导通路分析;(3)用于药物靶点筛选、疾病治疗。 实验方法原理: 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启 …
阅读更多 »shRNA转染后,什么时候做RT-PCR最好?
shRNA转染后,进行RT-PCR的最佳时间取决于多种因素,包括细胞类型、转染效率、shRNA的表达和目标基因的降解速度。一般来说,在转染后的24到72小时内进行RT-PCR是比较常见的时间点。具体来说: 24小时后:在这个时间点,可以开始检测到shRNA的表达以及目标基因的初步下调情况。对于一些高效的shRNA,这个时间点可能已经有显著的基因沉默效果。 4 …
阅读更多 »双脱氧法DNA 测序常见问题
问题 可能原因 解决方法 放射自显影片空白 DNA 聚合酶失活 标记物太旧 用对照引物、模板及试剂进行试验 试剂太旧 替换缺陷试剂 不正确或有缺陷的引物 不正确或有缺陷的模板, 曝光失误(如保留了保鲜膜,凝胶对着胶片的背面等 改正错误 整张放射自显影片太亮/标记物掺入不足 标记物太旧 采用新标记物 酶活性太低 采用 …
阅读更多 »动物基因组DNA的提取
实验原理 在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动构基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100-150 kb,适用于构建基因组文库和 Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤,以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。 仪器、材料与试剂 (一)仪器 1 . 台式离心机 2 …
阅读更多 »做无菌实验前,你需要做好这些准备
工作区域尽可能地远离通风口和交通口。不应该开窗工作,也不要靠近门口。通风橱能够帮助无菌状态的保持,但它也不一定完全保证。 确保整洁的工作环境。拿走所有不用的仪器和设备,旧容器和箱子也不要放在近处,做完实验后,收拾干净实验台。 实验前用消毒剂或是清洁剂清洁工作区域。70 %的乙醇是最常用的(但也要根据不同实验室的情况决定,因为酒精不一定对那些特殊的污染物有效) …
阅读更多 »揭秘RNAi,缔造实验神话
用siRNA进行transient transfection不稳定,几代细胞以后,症状就会消失,所以在转染几天(1-3)后要立刻抽提蛋白,进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染,如果质粒含有抗生素位点,可以进行筛选,获得较稳定的细胞株系,但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染(infection),抗生素筛选后,可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …
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