英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
本方案(Chomczynski1993) 可以从部分组织或细胞中同时提取RNA 、DNA 和蛋白质。像它的前身(Chomczynski and Sacchi 1987) 一样，此方法涉及用异硫氰酸胍和苯酚的单相溶液裂解细胞。加入氯仿产生第二（有机）相，从而DNA 和蛋白质被抽提，而RNA留在水相上清中。有机相中DNA 和蛋白质的分离，通过按顺序用乙醇、异丙醇 …
阅读更多 »PCR-SSCP实验步骤
一．样品制备 1．PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。 2．PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ul SSCP上样缓冲液（变性缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶 …
阅读更多 »RNA 定量-紫外（UV） 分光光度法
在进行大多数RNA 分析之前， RNA 定量是一种重要和必需的步骤。RNA 定量方法可以分为两类：紫外(UV) 分光光度法，此方法基于嘌呤和嘧啶碱基的吸收光谱； 基于荧光染料的方法，结合到核酸时选择性发荧光，测定荧光染料的强度。如果RNA 样品是纯的（ 如没有诸如蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染），用UV 分光光度法测量被碱基吸收的UV 射线简单而且精确。 …
阅读更多 »什么是反向PCR？
1、原理 反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究. 2、目 …
阅读更多 »小RNA 的Northern 杂交分析
该方案描述如何运用Northern 杂交检测15~150 个核昔酸的小RNA （图1) 。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总RNA, 再采用半干法进行转膜。RNA 通过紫外线照射交联至尼龙膜上，在Church 缓冲液中对RNA 和α-32p标记的寡核昔酸探针进行杂交，并用磷酸成像分析技术(phosphorimager analysis) 进行检测分析。使用包含两个 …
阅读更多 »昼夜节律转录因子BMAL1在生殖内分泌学和生育中的关键作用
脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白1（BMAL1）是昼夜节律振荡的核心成分，参与了许多生理活动。越来越多的证据表明BMAL1在生殖生理学中发挥着重要作用。 2022年3月2日，Yin Jiang 等人在Front Endo-crinol（Lausanne）上发表了一篇题为Critical Roles of the Circadian Transcription Fa …
阅读更多 »质粒DNA细胞转染实验效率影响因素有哪些？
质粒DNA细胞转染实验效率影响因素有以下几方面： 1， 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质 …
阅读更多 »PCR （多聚酶链式反应）
PCR 是1985 年由Kary Mulis 在Cetus 公司发明的，是一种体外复制和扩增DNA的方法。 DNA模板首先在高温下变性，当温度降低时，DNA 两侧的寡核苷酸引物与互补序列结合，在DNA聚合酶作用下，随着温度的缓慢提升，引物逐渐延伸，两条引物之间的区域被合成。然后DNA再次变性，引物再次结合，DNA的合成再次进行，这样周而复始，重复20 …
阅读更多 »PCR实验步骤及常见问题汇总
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。 一、 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成： ① …
阅读更多 »Real-Time qPCR常见的八大问题分析
1. 无Ct值出现 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Ct值出现过晚（Ct>38） 扩增效率低: 反应条 …
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