下列步骤描述了使用Cy3作为代表性标记试剂, 用荧光succinimidy l 活性酶标记羊抗体。其他水溶性荧光标记物的使用与此类似(Mujumdar et al. 1993) 抗体分离与纯化 来源于血清,腹水或培养基的抗体,在标记反应开始以前,需纯化以除去蛋白质和其他含有氨基团的分子。在与标记反应混合以前,抗体不应进行强缓冲处理,不然标记混合物会降低,所有 …
阅读更多 »TUNEL分析
TUNEL方法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-地高辛配基切口标记)源自完整固定的细胞核DNA 裂解部位标记(如Gavrieli et al. 1992)。 该法可用于组织切片、玻片上细胞生长、流式细胞计量术分析,用于组织切片的改进程序由Naik 及其合作者提出(Naik et al. 1996) ,叙述如下 1、组织切片的TUNEL 染色1)取下组织, …
阅读更多 »JAM分析
此分析方法基于用[3H] -胸腺嘧啶脱氧核苷标记核DNA, 用玻璃纤维滤器获得样品。 凋亡产生的DNA 片段小到可以通过玻璃纤维滤器,因此特定样品的放射活性减少。很显然,这种分析对循环的细胞是必需的。 实验前一天,将细胞接种于新鲜培养基。对数生长期细胞可更好地掺入[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷。 收获细胞,在新鲜培养基中以1×106细胞/ml重悬,用5 …
阅读更多 »细胞凋亡检测
方法 细胞类型 特点 说明 形态学/细胞旋转 不限 简单,快速,低廉,贮存无限制 略带主观性,但可靠 Hoechst染色 不限 极快,不能贮存 略带主观性,但可靠 吖啶橙/溴化乙锭 不限 极快,不能贮存 凋亡初期可用,略带主观性,但可靠 电子显微术 不限 耗时,昂贵 可靠 FACS/FSC SSC 非贴壁细胞 简单,须即时进行 客观,仅能提示凋亡 FAC …
阅读更多 »如何分离成纤维细胞?
下述的通用操作方案适用于小鼠、大鼠、仓鼠和鸡胚胎。选择大约一半足孕时间的胚胎最好,10 ~ 13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞,成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 胚胎的分离 适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠) 采用认可的方案处死啮齿动物 立即在无菌超净台内用70%乙醇擦洗整个动物。若可能,置紫外灯下照射5分钟 用无齿的摄子和剪子在前腿下作一腹部水平切 …
阅读更多 »单层细胞如何用胰蛋白酶处理?
下述方案描述的是采用胰蛋白酶处理细胞,进行细胞的传代或收集。维持细胞系的方法通常为每周传代一次,在传代的前一天换培养液;但是某些细胞系需要更频繁的传代。每种细胞系应单独传代以免细胞系交叉污染。超净工作台内不能同时放置一个以上细胞系。 吸干培养单层细胞的细胞培养瓶或培养皿中的培养液。 加入0.05%胰蛋白酶工作液(T-25 细胞培养瓶加入1ml; T-75 细 …
阅读更多 »如何利用好腺病毒感染的原理和特点?
一、原理 腺病毒(Adenovirus,Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒,其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型,大多数Ad载体都是基于血清型2和5,通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制,因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 二、特点 1) 几乎可以感染所有类型的细胞 2) …
阅读更多 »如何利用好慢病毒感染的原理和特点?
一、原理 慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体,与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非 …
阅读更多 »如何选择慢病毒和腺病毒系统?
慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较 病毒表达系统 慢病毒表达系统(Lentivirus) 腺病毒表达系统(Adenovirus) 病毒基因组 RNA病毒 双链DNA病毒 复制 自主复制 自主复制 是否整合 病毒基因组整合于宿主基因组,长时间、稳定表达外源基因 病毒基因组游离于宿主基因组外,瞬时表达外源基因 感染细胞类型 感染分裂和不分裂细胞,适用于难转染的原 …
阅读更多 »如何做好Northern Blot实验?
准备阶段:1.180度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用双氧水浸泡过夜,用DEPC水冲洗,干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用DEPC水冲洗二次,去除RNAZap。 制胶: 1. 称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中,加入 …
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