【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试 …

1.样品处理： 培养细胞：收获细胞1~5×107，加入1ml Trizol（异硫氰酸胍/酚）（在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol），混匀；用1ml注射器反复抽取（约30次）以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。 组织：取50~100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置5ml EP管中，加入1ml Trizo …

原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的 …

【试剂与器材】 （一）试剂 1． 0.1mol/L NaOH ，每组200mL 2． 寡聚Oligo（dT）-纤维素 3． 加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(p …

【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1×10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中rRNA为75％～ 85％，tRNA占1 …

冰冻切片法是组织化学，特别是酶组织化学最常用的切片技术，固定或未固定的组织样品均可进行冰冻切片，新鲜组织冰冻切片对组织细胞内酶类保存最佳，尤其对热、酸、碱、有机溶剂等耐受能力弱的酶和化学物质更加适用。冰冻切片也是免疫细胞化学研究中常用的切片方法，能够较完好地保存多种抗原，尤其是表面抗原的抗原性。 在冰冻切片中，组织中水分易形成冰晶，往往影响酶和抗原的定位。一 …

组织化学中的组织切片主要有石蜡切片法、冰冻切片法和振动切片法等。石蜡切片法比较节省时间，操作容易，可切极薄的组织片(4 μm 以下，通常为6~10μm 厚的切片），能做连续切片，且组织块可包埋在石蜡中永久保存。但石蜡切片只能用于较小的组织块，不适用于大的组织块。石蜡切片法能改变组织内的化学反应，甚至使可显示的酶和其他物质（如脂类）完全丢失，或使蛋白质变性、酶 …

1. 包埋剂的配制 (1) 配方Ⅰ : 环氧树脂618 10 ml 十二烷基琥珀酸酐（DDSA) （硬化剂） 5 ml 甲基内次甲基二甲酸酐(nadic methyl anhydride, MNA) （硬化剂） 8 ml 苯二甲酸二丁酯（DBP) （增塑剂） 3 ml 2, 4, 6-三（二甲氨基苯酚） （ DMP-30) （加速剂） 0. 2 ml (2) …

理想的电镜包埋剂(electron microscopic embedding media) 应具有以下性质：黏度低，易透入，聚合均匀，聚合后体积收缩小，能耐受电子轰击，高温下不变形，对细胞成分提取少，精细结构保存良好，在电镜的高倍放大下，不呈现可见结构，有良好的切割性能，有适当的反差，对人体无害等。但实际上，现在所用的各种包埋剂都各有利弊。 包埋剂的种类很 …

石蜡包埋法是组织学制片中最常用的方法、石蜡(paraffin)是由石油中分离出来的一种甲烷， 系固体碳化氢， 呈蜡样半透明的结晶块状。切片用石蜡应选优质的品种， 要纯而透明， 并有适当黏性。根据熔点的不同，有软蜡和硬蜡之分，软蜡的熔点为52~56°C ，硬蜡为60~62°C 。在室温高时用硬蜡，室温低时用软蜡；薄切片宜用硬蜡， 厚切片宜用软蜡。新蜡内含气体， …