原创文章，转载请注明出处。 正当我兴致勃勃准备去找导师说试剂的事，舍长突然来电了。 “喂，你搁哪儿呢，快来园艺学院201，急事，特急！”还没等我说好，电话就被挂了。 这语气听起来倒是挺急的，我也不耽误，赶紧去救我舍长于水火之中。 毕竟，明早还得仰仗他给我带早饭呢。 火速蹬着自行车到了园艺楼，跨步上了楼梯，冲到201门口：“舍长，我来了!“ “快，来帮我整死这 …

原创文章，转载请注明出处。 生物硕士苦啊，2年多了。课题仍然停滞不前。 话说我是一枚研究大脑基因功能的小硕，具体研究的是大脑某神经相关基因的功能，这个基因的功能事关人的智力认知，研究好了，会造福人类，想想真是激动啊。 可想想我的研究，却一点也无法激动。实验卡住了，卡住了……，拯救愚蠢的人类不容易啊！我不想拯救了，我硕士快毕不了业了！ …

在众多依赖于活细胞将底物转化为生色产物的活力检测方法中，由Mossman ( 1983 )建立的MTT 法仍是最通用、最流行的方法之一。在MTT 法中，水溶性的黄色染料MTT [3-(4 , 5 － 二甲基噻唑－2)-2 , 5 －二苯基四唑溴盐］ 在线粒体还原酶作用下转化为不溶性的紫色甲臜（ 图1 ) 。随后甲臜被溶解，其浓度通过570nm 下的OD 值被 …

图1 乳酸脱氢酶催化的可逆反应 常用的细胞毒性测定方法的基础是测量受损细胞释放的胞浆酶的活性。乳酸脱氢酶( LDH ) 是一种所有细胞中均存在的稳定的胞浆酶。在不同类型的组织中存在5 种不同的乳酸脱氢酶异构体，它们在数量、特异性和酶作用动力学方面存在差异。但所有不同的酶异构体均催化相同的丙酮酸和乳酸相互转化，伴随着NADH 氧化为NAD+的反应（图1) 。当 …

水溶性染料 alamarBlue 已用于体外定量多种类型细胞的活力( Fields and Lancaster 1993; Ahmed et al. 1994 ) 。该试剂极其稳定且无毒，因此可用于长时间连续监测细胞( Ahmed et al. 1994 ) 。基于上述原因， alamarBlue法被认为优于MTT 检测等经典的细胞活力检测方法。在一个比较实 …

试剂 运载 DNA l0mg/mL 细胞生长培养基 电穿孔缓冲液 指数生长的培养细胞 线性化或环状质粒DNA ( 1 ~ 5μg/μL , 溶于无菌去离子水） 磷酸盐缓冲液( PBS ) 胰岛素 设备 电穿孔杯 电穿孔仪器 血细胞计数器 组织培养皿或多孔培养板 组织培养瓶（75cm2） 方法 准备电穿孔用细胞。 对于贴壁细胞 电穿孔前一天，通过胰酶消化释放贴 …

电穿孔效率受以下几种因素的影响： 外加电场的强度。电压过低，培养细胞质膜的改变不足以允许DNA 通过； 电压过高，细胞会受到不可逆的损伤。对于大多数哺乳动物细胞系， 电压250~ 500V/cm时可达到最高瞬时表达水平。通常经过电穿孔， 20% ～ 50％的细胞能够存活（根据台盼蓝拒染法的检测结果） ( Patterson 1979; Baum et al. …

与之前文章中介绍的DEAE－葡聚糖方法相反，此替方案采用较低浓度的DEAE－葡聚糖( 250μg/mL) ，与细胞作用的时间较长（达8h) 。尽管不如使用高浓度DEAE－葡聚糖的转染效率高，但低水平的DEAE－葡聚糖细胞毒性小。 试剂 DMEM 培养基 HEPES 缓冲的DMEM 培养基 方法 转染前24h, 通过胰酶消化收集指数生长的细胞，按105 个细胞 …

DEAE －葡聚糖介导的转染与磷酸钙共沉淀介导的转染在三个方面有重要的不同。第一，该方法用于克隆基因的瞬时表达，而不是细胞的稳定转化(Gluzman 1981 ) 。第二，该方法对BSC-1 、CV- 1 和COS 等细胞系非常有效，但对许多其他类型的细胞转染效果不理想。第三， DEAE－葡聚糖转染的DNA 用量比磷酸钙共沉淀转染少。采用0.1 ~ 1.0μ …

所有的转染实验均应包括对照，以检验各个试剂和制备的质粒DNA , 以及检测将要引入的基因或构建体的毒性。 瞬时表达的对照 阴性对照 在瞬时转染实验中，需要用载体DNA 和/或用于稀释待测质粒或基因的缓冲液转染一两个培养皿的细胞。通常采用鲑鱼精DNA 或用于构建重组体的空载体等其他惰性载体代替待测基因转染贴壁细胞。转染后，培养的细胞不应从培养皿上脱落，外观上也 …