PCR实验步骤及常见问题汇总

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。

一、    聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)

PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成：
①     模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;
②     模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③     引物的延伸：DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
④     重复循环变性–退火–延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

试剂
DNA模板，与特定DNA模板结合的引物，去离子水，商业化的DNA聚合酶以及缓冲液，dNTP, MgSO4（可选）和DMSO（可选）

PCR反应开始前的准备工作
PCR反应开始前，你需要准备好DNA模板（基因组DNA或者反转录制备的cDNA）,特异性的引物（手动设计或利用软件设计）并选择合适的商业化DNA聚合酶（根据实验的目的不同做出决定）。

1.    DNA聚合酶的选择。市面上有多种DNA聚合酶可供选择，他们的特性也各有不同。因此你需要选择最适合自己实验需要的产品。通常我们将DNA聚合酶分为高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到没有任何突变的PCR产物，那应当选择高保真聚合酶。若你只是希望判断特异性序列的存在与否，那普通的Taq聚合酶已经足够。另外要注意的一点是，进行T载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的，因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶。
2.    引物。引物特异性会影响到PCR反应成功的可能性，好的引物设计对PCR成功至关重要。设计引物时，有以下几条原则需要谨慎考虑：
1.    引物长度。通常PCR引物长度在18-22个碱基之间。这对引物的特异性以及退火温度而言均已足够。
2.    解链温度Tm。Tm值的定义是使得一半双链DNA解螺旋成为单链DNA的温度。引物的Tm值通常要在52-58度之间。
3.    GC含量。最适合的GC含量为40-60%。
就目前而言很多软件都可以用来设计引物，如primer5和Oligo。通常这些软件设计得到的引物均可以满足需要。

步骤
准备好各种试剂和PCR仪，就可以开始PCR实验：将各种试剂混合并按照说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下：

1. 起始步骤：这对于热启动PCR而言是必须的，将反应混合液加热至94-98度以激活DNA聚合酶。这一步的时间取决于所选用的DNA聚合酶。
2.    变性步骤：DNA本身是双链结构，而DNA扩增需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至94-98度保持20-30秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链DNA。这是PCR循环中的第一步。
3.    退火步骤：变性之后，DNA模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与DNA模板互补，当反应温度降至50-65度时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。这一步通常维持20-40秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始DNA合成。
4.    延伸步骤：在这一步，DNA聚合酶开始DNA合成，因此这一步的温度选取的是DNA聚合酶的最优温度。通常我们选用72度，但某些DNA聚合酶的最适温度是68度。这一步与体内的DNA复制很相似：DNA聚合酶按照碱基互补规律将dNTPs加到引物的3’末端最终得到新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA。
5.    第2步至第4步称为一个循环：每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍。通常一次PCR反应进行30-35个循环。在前几轮的PCR循环过程中PCR产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此PCR反应的产量也受到了限制。
6.    最后的延伸步骤：当30-35个循环结束后，我们通常会以68-74度延伸5-10分钟，这是希望使反应体系中残留的单链DNA全部反应完毕。
7.    维持时间：通常我们设置4-10度为反应后PCR产物的保存温度。

二、PCR常见问题汇总

1. 无扩增条带
（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。
（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

2. PCR产物量过少
（1）    退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（2）    DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）    PCR循环数不足。增加反应循环数。
（4）    引物量不足。增加体系中引物含量。
（5）    延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。
（6）    变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
（7）    DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

3.    扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
（9）若为PCR试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

4. 扩增产物出现多条带 （杂带）
（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
（8）    复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
（9）    反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
（10）    引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11）    引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）    模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）    外源DNA污染。确保操作的洁净。

5.阴性对照出现条带
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
6.条带大小与理论不符
1)    污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
2)    模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3)    基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。