免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解（四）

基本方案4   胃蛋白酶水解IgG 获取F (ab’)₂ 片段的大量制备

材料

• ≥1mg/ ml 纯化的IgG
• 适当pH 的乙酸缓冲液 : 0. 2mol/L 乙酸钠，用冰乙酸调至所需pH
• 2mol/L Tris 碱
• PBS, pH8.0
• 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B
• 半胱氨酸，可选
• 碘乙酰胺结晶，可选
• 聚丙烯酰胺葡聚糖S-200 Superfine
• 硼酸缓冲液，可选
• 10% (m/V) NaN₃ , 可选
• 5mm X 100mm 层析柱
• 26mmX900mm 层析柱

流程

1. 将浓度≥1mg/ml lgG 对着合适pH 的乙酸缓冲液透析，测定A₂₈₀值确定IgG 浓度 。
2. 加入合适pH 的乙酸缓冲液配制0.1mg/ml 胃蛋白酶， 使得E/A 比为1 : 20 。将酶、抗体混合液置于37°C 至所需时间 ，在每毫升反应液中加入约 50μl 2mol/L Tris 碱中止反应。如有需要，用pH 试纸检测pH 是否为8.0, 也可加入更多量 Tris 碱。
3. 将混合液转至透析袋中， 4°C 下对着1L PBS pH8.0 的缓冲液透析。
4. 将透析液上样至5mmX 100mm 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 层析柱上，收集未结合的流出液。
5. 可选：为了减少F (ab’)₂ 水解成Fab’，加入半胱氨酸至终浓度为0.01mol/L, 混匀，在37°C下孵育2h。如有必要进一步碱化，可以向混合液加入碘乙酰胺0.15mo1/L，用下述步骤纯化去除Fab’ 片段。
6. 将流出液浓缩至≤5ml  。
7. 将浓缩液上样至26mmX900mm 聚丙烯酰胺葡聚糖S-200 Superfine 层析柱上，用紫外检测器或分光光度计检测洗脱下的蛋白质峰。用SDS-PAGE 法或者预平衡的凝胶层析柱确定片段成分，收集分子质量大小为110kDa 的组分。
8.  鉴定终产物的纯度，用10%SDS 还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样量为1 ~20μl。在非还原凝胶电泳上， F (ab’)₂ 片段在110 kDa 处显示一条带，在还原凝胶电泳上， F （ab’）片段在25kDa 处显示为单一条带或为二聚体。
9. 测A₂₈₀值，确定F(ab’)₂片段浓度。在绷酸缓冲液中的F (ab’) ₂ 片段可在4°C保存，在含10% (m/V) NaN₃的PBS 中的F (ab’)₂片段可在- 70°C保存。