免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解（二）

基本方案2   木瓜蛋白酶水解IgG 获取Fab 片段的大量制备

材料

• 木瓜蛋白酶 ( 2 X 重结晶悬液 )
• 水解缓冲液：0.02mol/L EDTA （ 二钠盐） / 0.02mol/L 半胱氨酸／PBS （新鲜配制，冰上保存<10h)
• 溶于PBS 中浓度≥1mg/ml 的IgG （ 总量≥5mg )
• 碘乙酰胺结晶
• PBS, pH8. 0
• 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B
• 聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200 Superfine
• 硼酸盐缓冲液， 可选
• 10% (m/V) NaN₃ , 可选
• 5mmX100mm 层析柱
• 26mm X 900mm 层析柱

流程

1. 混匀木瓜蛋白酶悬液，避免振荡。加入与待水解抗体相等体积的水解缓冲液溶解木瓜蛋白酶，选择从摸索性试验中已确定的最佳酶量、抗体浓度和孵育时间进行实验。
2. 将木瓜蛋白酶液加入浓度为≥1mg/ml 溶于PBS 的IgG 中，混匀， 37°C 水浴至所需时间 。加入结晶碘乙酰胺至终浓度0. 03mol/L 中止水解反应，小心混匀，确保碘乙酰胺完全溶解。
3. 将反应液转至透析袋中 ，在4°C 下对2L PBS pH8. 0 透析12~20h 。
4. 准备5mmX100mm 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 层析柱将透析液上样。收集含有Fab 片段和酶的未结合流穿液。如有需要，用PBS 充分洗柱，收集所有Fab 片段。
5. 将含有Fab 片段的流穿液浓缩至≤5ml 。
6. 将浓缩液上样至26mm X900mm 聚丙烯酰胺葡聚糖S-200 Superfine 层析柱，收集分子质量大小为50kDa 的组分，用SDS-PAGE 法鉴定分子质量大小或使用预平衡的凝胶过滤层析柱。
7. 将1~80μl 终产物用10 ％非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定终产物的纯度。通过测定A₂₈₀值，确定Fab 片段浓度 。将Fab 片段保存在硼酸缓冲液中，于4℃保存；或者保存在含0. 02% NaN₃ 的PBS 中，于- 70°C保存。