限制酶和DNA 甲基化酶

限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列之内或其附近的特异位点上，井在此切割双链DNA 。它可分3 类，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。

I 类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用及依赖于ATP 的限制（切割）活性。Ⅲ类限制酶在识别位点上切割DNA ，然后从底物上解离。而I 类限制酶结合于识别位点，但却随机地切割回转到被结合酌处的DNA 。在分子克隆中I 类和Ⅲ 类限制酶都不常用。

Ⅱ 类限制－修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。迄今人们已经分离出大量II 类限制酶，其中许多已常规应用于分子克隆中。

绝大多数II 类限制酶识别长度为4 、5 或6 个核苷酸目呈二重对称的特异序列，但有少数酶识别更长的序列或简井序列。切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异：一些酶恰在对称轴处同时切割DNA 的两条链产生．带平端的DNA 片段；而另一些酶则在对称轴两侧相类似的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端的DNA 片段。

通常，不同的限制酶有不同的识别序列。然而，有许多不同来源的限制酶可切割同靶序列，这些酶即称为同裂酶。

甲基化酶

• Dam 甲基化酶

Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N⁶ 位置上引入甲基。一些限制酶（PvuⅡ, BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、 Sau3AⅠ）的识别位点中含 GATC 序列，另一些酶 ClaⅠ（1/4）、 XbaⅠ（1/16）、TaqⅠ（1/16）、MboⅠ（1/16）、 HphⅠ（1/16） 的部分识别序列含此序列，如平均 4 个 ClaⅠ 位点（ATCGATN）中就有一个该序列。

有些限制酶对 Dam 甲基化的 DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等。对甲基化不敏感的有 BamHⅠ、 Sau3AⅠ、 BglⅡ、 PvuⅠ 等。 MboⅠ 和 Sau3AⅠ 识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。

一般哺乳动物 DNA 不会在腺嘌呤 N⁶ 上甲基化，因此对甲基化敏感的限制酶切割这些 DNA 不会受到影响。当需要在这些敏感位点上完全切割 DNA 时，可利用 dam- E.coli 扩增并提取 DNA 。

• Dcm 甲基化酶

Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受 Dcm 甲基化作用影响的酶有 EcoRⅡ（↓CCWGG）。大多数情况下，其同裂酶 BstNⅠ（CC↓WGG）可避免这一影响，因为二者识别序列虽然相同，但切点不同。

受此甲基化酶影响的酶还有 Acc65Ⅰ、 AlwNⅠ、 ApaⅠ、EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等。不受此甲基化影响酶有 BanⅡ、 Bg1Ⅰ、 BstNⅠ、 KpnⅠ 和 NarⅠ 等。

• EcoKⅠ 甲基化酶

EcoKⅠ 甲基化酶的识别位点少，识别 AAC（N）6GTGC 和 GCAC（N）6GTT 序列中 A 的 N⁶ 位置。但因为识别位点少（1/8kb），所以研究较少。

• SssⅠ 甲基化酶

SssⅠ 甲基化酶来自原核生物 Spiroplasma ，可使 CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化。甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化链（新合成链）的 DNA 链。 SssⅠ 甲基化的 DNA 受 E.coli 中 mcrA、 mcrBC、 mrr 系统的限制。许多酶对此甲基化敏感，如 AatⅡ、 ClaⅠ、 XhoⅠ、 SalⅠ 等，也有不敏感的，如 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 SphⅠ 和 KpnⅠ 。