测序胶的灌制、电泳及处理

推荐用6 ％丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶：一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息；另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程，采用6 ％丙烯酰胺，可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶，使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。

材料

• 盛于喷射洗瓶的异丙醇或70% (V/V) 乙醇
• 5% (V/V) 二甲基二氯硅烧的氯仿溶液
• 变性丙烯酰胺溶液
• TEMED
• 10% (m/V) 过硫酸铵( APS，每周新配一次，储于4℃ ）
• 1 XTBE 电泳缓冲液， pH 8. 3~8. 9
• 溶于甲酰胺／染料溶液中的测序样品
• 5 ％ 乙酸／5 ％ 甲醇(V/V) 固定液（可选）
• 30 cmX40 cm 测序胶前后玻璃平板
• 0. 2~0. 4 mm 厚度均一的垫片
• 大的图书装订夹
• 60 ml 注射器
• 0. 2~0.4 mm 鲨鱼齿或常规样品梳子
• 测序凝胶电泳装置和电源
• 巴斯德吸管或Beral 细管
• 34 cmX22 cmX0. 4 cm 的铝盘（可选）
• 测序加样移液器吸头
• 浅的固定托盘（ 可选）
• 46 cmX 57 cm  3MM 转印纸
• 干胶机，预热到80℃
• X 射线盒和Kodak XAR-5 X 射线胶片

步骤

1. 首先要用肥皂及水小心严格地清洗一对30 cmX40 cm 玻璃平板，用去离子水彻底冲洗后晾干。用喷射洗瓶喷异丙醇或70 ％乙醇使平板湿润，然后用Kimwipe 纸或其他无绒纸巾将平板擦干。
2. 戴手套在通风橱中工作，用浸湿了含5 ％二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe 纸在每片平板的其中一面加一层此溶液，并小心擦拭整面平板。待硅化层干后， 用Kimwipe 纸以70 ％乙醇或异丙醇擦净并干燥，最后再检查平板有没有灰尘或其他颗粒。
   
   
3. 按厂商指南用0. 2~0. 4 mm 均厚的垫片和大的书本装订夹子组装凝胶胶板，注意垫片与平板的边、底压紧对齐。
   
   
4. 制作每块凝胶时，在100 ml 烧杯中配制60 ml 变性丙烯酰胺凝胶溶液。在灌胶前，彻底混匀60 μITEMED 和0. 6 ml 10％过硫酸铵于丙烯酰胺溶液中，以起始聚合反应。
   
   
5. 将丙烯酰胺溶液注入60 ml 注射器，避免产生气泡。让短平板朝上，并使凝胶平板夹层与桌面成45°角，沿着平板的一边慢慢将丙烯酰胺溶液推入两片平板之间。除去气泡，可以敲打或摇动平板，直至气泡浮到胶液上面。
   
   
6. 当溶液达到短平板的顶部时，放下胶模夹层至某一角度，使其顶部边缘离操作台平面仍有5 cm 左右。将0. 2~0. 4 mm 厚的鲨鱼齿样品梳或常规样品梳子的平齐一侧插入胶液中，至短平板下约2~3 mm, 操作须十分小心以避免产生气泡。用一个书本装订夹将平板之间的样品梳夹紧，以避免在梳子与平板间形成凝胶固块。加一层过量的丙烯酰胺溶液至梳子，保证其被完全覆盖。用水冲洗注射器除去过量的丙烯酰胺。
   
   
7. 观察聚合反应。如果有胶漏出，用书本装订夹夹紧漏胶部位，以减缓漏胶或使漏胶停止。
   聚合反应的时间（通常为10 min~2 h) 依赖于温度和TEMED 及APS 的用量。聚合反应完成时，在梳子和凝胶表面交界处可以观察到界面。
   
   
8. 除去底部垫片，用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液，用刀片除去样品梳周围的过量聚丙烯酰胺凝胶，然后轻轻拔出梳齿，避免挤压或拉伤凝胶（或加样孔）。用水清洗梳齿，准备好在步骤11 使用。
   
   
9. 凝胶电泳装置的下层储液槽加入1XTBE 缓冲液，使凝胶夹层能浸泡在2~3 cm 的一层缓冲液中，将凝胶夹层放在装置上。先让凝胶夹层的一角进入缓冲液，这样随着另一角的下垂凝胶夹层底部边缘的气泡就会被赶出来。根据制造商的说明书，将玻璃板固定在装置上。
   
   
10. 上层储槽倒入1 X TBE 缓冲液，使超过凝胶顶部约3 cm, 用巴斯德吸管或Beral 细管以1XTBE 清洗凝胶顶部，除去过量的聚丙烯酰胺和尿素。
11. 将清洗干净的鲨鱼齿样品梳重新插回凝胶夹层，使齿尖刚刚插入凝胶，用巴斯德吸管或Beral 细管以1XTBE 缓冲液彻底清洗加样孔，以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。
12. 加样前，在45 V/cm 凝胶的电压降下预电泳，使凝胶预热，即在1700 V 、70 W 恒定功率下电泳约30 min （或根据制造商的说明书）。
    为了保证在电泳过程中传热均匀，可以将一块铝板贴在前面玻璃板上用书夹夹紧。铝板一定不能接触到下槽的缓冲液中。
    
    
13. 在甲酰胺／染料溶液中加入测序样品， 95°C 加热2 min, 然后置于冰上。在加样前，清洗加样孔除去浸进孔中的尿素。用测序加样吸头加样（每次加样后冲洗2 次），每孔加样2~3 μI。为了看到每个样品的轨迹，在玻璃板外侧为每个泳道或每系列4 个反应／泳道做好标记。
14. 根据制造商的推荐，在45~70 W 恒定功率下电泳，凝胶温度保持在约65°C 。监视标记染料的迁移 。
    
    
15. 电泳完毕时，排出上下液槽的缓冲液，并按放射性废物处理丢弃液体。从电泳装置中取出凝胶夹层，并在冷自来水下冲洗直至两面玻璃平板表面都冷却为止。
    
    
16. 将夹层平放在纸巾上，凹口玻璃平板（短平板）朝上，除去多余的液体及夹子。取出一边的垫片。两片玻璃平板之间插入一个长的金属压舌板，轻轻转动压舌板将玻璃平板撬起使之分开。凝胶应贴在下面的玻璃平板，如果贴在上面的平板，则将它翻转过来。慢慢分离上面玻璃板，使之完全与凝胶分开。移去第二个垫片和周围多余的聚丙烯酰胺碎片。
    
    
17. 如果样品含³⁵S ，直接将凝胶连同玻璃平板一起放人浅托盘中，轻轻覆盖一层约2cm的5 ％ 乙酸／5 ％甲醇固定液，浸泡10~15 min, 不时轻轻摇动托盘使凝胶与玻璃平板松开。然后，小心地使凝胶保持在玻璃板的中央，靠吸力或重力完全除去固定液，小心从托盘中将平板连同凝胶取出，放在工作平台上。尿素会猝³⁵S 的信号。从含³² p的凝胶除去尿素并非必需，但可增加信号的清晰度。
18. 将两张干的Whatman 3MM 转印纸，叠齐如同一张一样，慢慢地放在凝胶的上面，从凝胶的一端开始缓慢地向另一端放下，以避免气泡的产生。从平板上剥起转印纸，凝胶应和它一起被揭起，逐渐从玻璃板上卷起纸／凝胶，直至剥离。
    
    
19. 将滤纸／凝胶放在预热( 80°C ） 的干胶机中，上面覆盖一张保鲜膜，避免产生气泡，将胶在80°C 中完全干燥(20 min~1 h) 。从干胶上揭去保鲜膜，将干胶放在X 射线曝光盒中， Kodak XAR-5 X 射线胶片直接与凝胶接触，不用增感屏
    在室温放射自显影（通常过夜）。