细胞的支原体检测——荧光指示细胞法

常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域，由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%），所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体DNA, 证明该细胞有支原体污染。

由于各种细胞的形态和培养状态都有差别，所以为了便于比较、观察， 该方法一般使用贴壁细胞VERO （非洲绿猴肾细胞）作为指示细胞，即将待检割细胞的新鲜上清液加入支原体阴性的VERO 细胞中培养48h ，然后固定、染色、观察。

（一）材料与设备

1．荧光显彼镜。
2.CO₂ 培养箱。
3.无菌小爬片。
4.无菌培养皿。
5.不含抗生素的完全培养液。
6.二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml) 。称取5mg 二苯甲酰胺荧光染料加入100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液中，在室溫下用磁力搅拌30~40min, 使完全溶解，－20℃ 避光保存。
7.二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述浓缩液，加至100ml 无酚红和碳酸氢钠的Hanks 溶液中，终浓度为0.5μg/ml 。
8.固定液，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液为细胞固定液。
9.封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml, 0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O 27.8ml, 丙三醇50.0ml，以上三者混匀，调pH 至5.5 。
10．不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液或PBS 。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO 细胞。

（二）操作步骤

1. 无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。

2.VERO 细胞爬片：将小爬片无菌置于小培养皿内，滴加VERO 细胞悬液

（细胞浓度约3×10⁴ 个/ml) 2~3ml, 置于CO₂ 培养箱内培养24h 使其贴壁。

3.制备标本。向6 孔板内滴加待检细胞上清液约1ml, 注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h 后( VERO 细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。

4.漂洗。将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、NaHCO₃ 的Hanks 溶液（或PBS) 漂洗3 次。

5.固定。用乙酸：甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。

6 . 漂洗。待固定液自然风干后用去离子水漂洗3 次。

7.染色。置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。

8.漂洗。去离子水中漂洗3 次，每次1 ~2min 。

9.封片，紫外激发，观察。

（三）结果判断

当阴性及阳性对照结果均成立时，结果有效 。

1. 阴性结果 仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。
2 . 阳性结果 荧光显缴镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。

（四）小结

1 . 严格配制工作液及封片液。
2 . 保证作为指示细胞的VERO 细胞没有被支原体污染。
3 . 必须同时设立阳性及阴性对照， 井注意重复，以排除假阳性和假阴性结果。
4. 应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。
5. 可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异性染色，如胞浆着色。