体外培养细胞的一般性质（四）

体外培养细胞的增殖特点

从培养时开始，培养物可从组织块培养的外迁细胞中获得，也可通过酶消化或机械方法分散组织获得。不管采用何种方法获得细胞，原代培养是一系列细胞选择过程的第一步，其最终结果是产生一个相对均一的细胞系。细胞从组织块培养中迁移出来的能力是选择的条件之一； 而对分散的细胞来说，只有那些在离散后黏附到了培养器皿底面上生存下来的细胞， 或悬浮时能存活的细胞才可以成为原代培养的基础。

如果原代培养能持续好几个小时，那么就需要进一步选择。其中，有增殖能力细胞的数目逐渐增多；有些类型的细胞虽然存活了下来了，但并不增多；有的细胞在特定的培养条件下不能存活。因此，在培养中，各种类型细胞的相对比率都会发生变化，如果是单层培养物，这种变化将持续到支持物被完全铺满为止。

在细胞汇合后（即可利用的生长空间均被占用，细胞彼此间紧密接触），那些对生长密度限制敏感的细胞就会停止分裂，而那些对生长密度抑制不敏感的转化细胞仍会继续生长，形成生长优势。因此，保持低细胞密度（如经常进行传代培养）有助于维待培养物的正常表型，如小鼠成纤维细胞。

经过第一次传代培养后，原代培养物就被称为一个细胞系，并可再增殖和传代多次。在细胞的每次连续传代培养中，群体中能快速增殖的细胞会逐渐占优势，而不能增殖或增殖缓慢的细胞会变得越来越少，这种现象在第一次传代后最为明显。增殖能力的差异加上对胰蛋白酶消化和传代操作损伤耐受的差异，共同决定了每种细胞在群体中的生长优势。

一些细胞系可形成连续细胞系。细胞系的待续生长能力反映了细胞系的遗传变异和选择作用。遗传变异常涉及p53 基因的缺失和突变。正常p53 基因能阻止细胞周期的进程，如果DNA 发生突变或端粒酶表达，细胞就会获得持续生长的能力。人类成纤维细胞在培养过程中一直维持其整倍体性，不会转化成连续细胞系。体外培养的小鼠成纤维细胞及一些人类或动物肿瘤细胞， 一般难以维持其染色体的整倍体性，常产生连续细胞系。许多人类连续细胞系的共性就是出现亚四倍体的染色体数目。这种通过培养导致的连续细胞系变化称为体外转化，这种转化能自发形成或被化学物质和病毒所诱导。永生化是指细胞获得了无限增殖的永久生存能力，而转化则代表生长特性的改变，如贴壁依赖性的丧失、接触抑制和生长密度抑制的丧失等，但这并不意味着就一定与肿瘤发生有关。连续细胞系通常都是非整倍体的，它的染色体数目一般都介于二倍体和四倍体之间。在培养的细胞群体中，通常还有相当多的染色体数目和组成变异（异倍体），至今还不消楚这种连续细胞系是来自从组织块向外生长的少量细胞，还是由一个或多个细胞转化形成的。

许多正常细胞不能产生连续细胞系，最经典的例子就是人的成纤维细胞，培养过程中始终保待染色体的整倍体性，并且在危机期（ 一般在50 代左右）将停止分裂，停止分裂后还可以再存活18 个月以上。人的神经胶质细胞和鸡的成纤维细胞也有类似的特点。另一方面，随着培养技术的不断提高， 表皮细胞的生命极限在不断延长， 并且能表现出连续的生长能力。

就单个细胞而言，其增殖是通过周期性分裂实现的。细胞分裂的周期可分为4 个时期。M 期是有丝分裂期，染色质浓缩成染色体，组成染色体的2 条染色单体分开，进入2 个子细胞中。G₁期是2 次细胞分裂的间隙，细胞要么进入下一个细胞分裂周期，要么可逆地退出细胞周期，进入静止期G₀。G₁期存在多个控制点，可控制细胞周期的进程，决定细胞重新进入细胞周期或退出细胞周期而进行分化。之后是S 期，即DNA 合成期， DNA 在这个时期复制。S 期之后是G₂期，是细胞分裂前的准备阶段，G₂期也存在控制点，可以控制DNA 的完整性，并保证细胞周期中DNA 修复的完成，若DNA 不能被修复，细胞则会发生凋亡。细胞凋亡是一个受控制的生理过程，可以清除群体中异常和受损的细胞。

就细胞群体而言，培养细胞的增殖，通常分为3 个时相。

延迟期(The Lag Phase) ：该期是指传代和再接种后细胞数没有增加的一段时间。这时期细胞适应新的环境，它们要补充胰蛋白酶消化时所丧失的细胞表面蛋白和细胞外基质，细胞要贴附到培养器皿的表面，然后铺展开来。在铺展过程中，会重新出现细胞骨架。此外，酶的数量如DNA 聚合酶也增加。接着开始DNA 和结构蛋白质的合成。某些特殊的细胞产物可能会消失。

对数期(the log phase) ：此期在延迟期之后，细胞数呈指数增加的时期， 井在达到汇合后以1 个或2 个群体倍增为止。对数期的长度取决于接种密度、细胞的生长速度及抑制细胞增殖的生长密度。在此期间生长分数很高（通常90%～100% ），细胞处于最旺盛的增殖状态。这是取样的最佳时间，因为细胞群体最均一，活性也最高。但此时相的细胞是随机地处于细胞周期中的，因此出于某种需要，常常要将它们进行同步化处理。

平台期(the plateau phase) ：此期连接于对数期末，细胞成为汇合状态，也就是可供生长的表面均被细胞占据，它们与其周边的细胞相互接触。汇合之后，细胞的生长速率降低，而且在某些情况下， 当1 个或2 个群体倍增之后，细胞增殖几乎彻底停止。至此阶段，细胞培养便进入平台期（或称静止期， stationary phase),生长分数为0%~10% ，细胞运动减少；某些成纤维细胞相互沿一定方向排列，形成典型的平行排列方式。它们能占据的基质表面积减少，与培养液的接触也减少。但是与结构蛋白相比，某些特殊蛋白的合成却有增加，细胞表面的电荷也可能发生改变。

细胞的运动和生长，因汇合或互相接触而停止，这一性质称为接触抑制(contact inhibition)。此后，人们又认识到正常细胞在汇合后生长的停止并不是仅仅是由于接触，还可能与细胞铺展的减少及营养不足有关，尤其是培养液中的生长因子不足。于是，人们以“密度限制”(density limitation) 代替接触抑制，来描述这一性质。

正常单层上皮和内皮细胞的培养在它们达到汇合后，便停止生长并维持为单层。然而，对于大多数培养，只要定期更换培养液，即使汇合后也会继续增殖（虽然生长速率很低），这样便形成了细胞的多层生长。人胚胎肺和成体皮肤成纤维细胞虽然会表现出运动的接触抑制，但只要有最适条件仍可继续增殖，它们在细胞层之间的胶原可叠加起来，直至达6 层或更多层。然而，这些成纤维细胞仍保持着有序的平行列阵。也正因为如此，严格地说起来，“平台期”和“静止期”的提法并不十分准确，使用时应谨慎。

通常， 与相应的正常细胞相比，自发转化或者以病毒或化学致癌物诱导转化的细胞都能达到较高的细胞密度，常伴有较高的生长分数及细胞增殖密度限制性的丧失。这些培养物的平台期是细胞增殖和细胞丢失之间的一种平衡。它们常常具有停泊非依赖性，也就是说它们能轻易地在悬浮条件下生长。