2025年 2 月 18日, 星期二
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如何制备双链siRNA?

本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。

试剂

丙烯酰胺: 双丙烯酰胺(19 : 1, 40%, m/V)
过硫酸铵( 10%, m/V)
复性缓冲液(10 X )
2 脱保护缓冲液100mmol/L(TEMED)pH3.8
DNA 分子质量标准
非变性凝胶上样缓冲液10X
无核酸酶水
siRNA
10mg/mL 溴化乙锭
TBE 缓冲液5X,0.5X

设备

离心机
加热模块37°C,60°C,95°C
微量离心管1.5mL
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪
分光光度计
真空离心蒸发浓缩器或者替代品
紫外灯
涡旋振荡仪

方法

1.将siRNA 溶解于无核酸酶水。使用分光光度计测量siRNA 的浓度 。将
RNA 溶液放置冰上以防止RNA 降解。
2.进行以下复性步骤,生成20μmol/L 的双链siRNA 溶液。

有义链siRNA 2nmol
反义链siRNA 2nmol
复性缓冲液10X 10μL
无核酸酶水 补足至100μL

3. 95 °C 孵育5mm, 37 °C 孵育2h 。将siRNA 溶液保存于-20°C 或者- 80 °C 。
4. 利用以下试剂制备一块浓度为12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(如Bio-Rad MiniPROTEAN,8cmX 7.3cmX 0.75mm)

TBE 缓冲液( 5 X )
丙烯酰胺: 双丙烯酰胺( 19: 1, 40%, m/V)
去离子水
1mL
1.5mL
补足至5mL
室温下混匀,而后加入  
过硫酸铁(10%, m/V)
TEMED
50μL
5μL

5. 迅速混匀上述溶液, 然后将其倒入制胶仪中使其聚合。
6. 将双链siRNA 溶解于2μmol/L 的1X 非变性胶上样缓冲液中。
7. 将正义和反义siRNA 分别溶解千4μmol/L 的l X 非变性胶上样缓冲液中。
8. 每个样品上样5μL, 在0.5 X TBE 缓冲液中进行电泳,电压5V 。电泳需要在低电
压条件下进行以避免样品受热变性。
9.电泳结束后,使用溴化乙锭(1 : 20000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液中)在室温下染色5min, 在紫外线下观察RNA条带。

配方


复性缓冲液10X

试剂 数量(配制100mL ) 终浓度10X
乙酸钾2mol/L 50mL 1mol/L
HEPES-氢氧化钾KOH lmol/L,pH7.4 30mL 300mmol/L
乙酸镁lmol/L 2mL 20mol/L
补足至100mL  
室温下储存。    

非变性胶上样缓冲液10X

试剂数量(配制100mL )终浓度10X
Ficoll-40015g15% (m/V)
Xylene cyanol FF250mg0 25% (m/ V)
溴酚蓝250mg0 25% (m/V)
补足至100mL 
分装为lmL, -20 ℃ 储存。  

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