Western Blot化学发光(ECL)淬灭的原因？

做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生，经常有朋友反映，加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光，可亮光很快就消逝了，压完片后，条带却很弱，甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么？

要解释这种情况发生的原因，必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H₂O₂、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H₂O₂氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强，增强剂在HRP-鲁米诺-H₂O₂体系中扮演着核心角色，决定着ECL化学发光的发展。理想的发光增强剂是：1.发光灵敏，目前一般的发光增强剂都可以将发光灵敏度提高1000倍至100000倍以上，可以检测pmol甚至fmol级别的HRP，发光的灵敏度实际上已不是问题。2.发光稳定，这是目前研究的重点之一，发光不稳定的增强剂，容易在一些情况下发生“淬灭”，即快速消耗发光试剂，在几秒钟内发强光，又在几秒钟内迅速消逝，不容易被检测的现象。3.本底或背景低，这是发展的方向之一，由于化学发光反应对增高本底的因素很敏感，因此，化学发光分析欲得到准确可靠的结果，就必须确保试剂的特异性，在无HRP或很少HRP的情况下，不发光或很少发光。

所以，Western Blot“淬灭”的原因主要在两方面：含HRP的抗体和发光试剂。由于长期应用某种发光试剂，人们多注意了抗体，不知道发光试剂其实也会对实验结果造成重大影响。对抗体方面来说，可以采用适当降低抗体的浓度，发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题；对发光试剂来说，可以选用发光稳定的发光试剂来解决“淬灭”的问题。

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