新型核酸分子荧光探针——分子信标的原理及应用

分子信标(molecular beacon)是一种具有发夹结构的新型荧光标记核酸探针，具有高灵敏度、高特异型，其在聚合酶链反应（PCR）、核酸序列的分析、活细胞内核酸的动态检测、蛋白质(酶)与核酸的相互作用等方面具有广泛的应用。

分子信标的结构

分子信标的结构一般包括三个部分：环状区、信标茎干区、荧光基团和猝灭基团。荧光基团一般联接在信标分子的5 端；猝灭基团联接在3’端。分子信标中常用4—(4’— 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为猝灭基团，德克萨斯红(TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作为荧光基团。

分子信标的原理：

自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大，荧光恢复。

分子信标通常都是修饰一个单一的发光基团。在一个均相体系中，通过杂交后荧光信号的变化，一种分子信标即可检测一种靶序列。为了实现在一个均相体系中同时检测多种靶序列的目的，可将不同的分子信标修饰以不同的荧光基团。

分子信标的应用：

分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。近来,人们通过改变经典分子信标的结构，设计出许多新型的分子信标，如用ssDNA链做环、用RNA-DNA双链做茎的RNA-DNA嵌合型分子信标，用PNA链代替ssDNA形成的PNA分子信标等。新型分子信标的出现为分子信标的进一步应用拓宽了领域。

1核酸检测分析

分子信标用于核酸检测分析体现在几个方面：实时定量PCR测定靶标的浓度，基因的点突变、SNP(单碱基多态性)、等位基因、多组份同时测定，活体内核酸的动态检测，等。

与常规核酸检测方法相比，分子信标用于核酸检测具有如下特点：

a 可以进行液相杂交检测：常规核酸检测方法主要为固相杂交，要把未结合的探针和引物分离后才能利用其他信号对靶核酸进行检测；分子信标可以直接加入核酸扩增体系进行检测，检测方法可以直接在紫外灯下或借助荧光光谱仪进行定量检测。

b 有效消除核酸交叉污染：利用分子信标可以直接对封闭微量离心管或多孔板中的核酸检测，完全避免核酸中间操作环节，彻底消除核酸交叉污染。

c可进行核酸实时(real time)检测：在PCR 体系中加入分子信标,并把PCR 仪与荧光光谱仪相连,可以对PCR 反应过程随时进行监测。d 特异性强：在对分子信标与靶序列杂交特异性研究中意外发现，与线性寡核苷酸探针相比，茎环状结构的分子信标检测特异性更高，对靶序列中单个碱基的错配、缺失或插入突变均能检测出来。

e 灵敏度高：分子信标可以直接检测核酸；在应用过程中常与PCR 等核酸扩增技术联合应用，因而低至1拷贝的核酸也能检测，敏感性很高。

f 可实现核酸大规模自动化检测：分子信标的最大优点是可以实现核酸的大规模自动化检测，分子信标在核酸检测应用中的例子充分证明了这一点。

g 可对活体内核酸动态进行检测：目前尚缺乏有效方法对活体内核酸直接进行研究，分子信标技术为对活体内核酸代谢转移等动态过程研究提供了可能并已用实验证实。

2. 分子信标用于研究DNA—蛋白质的相互作用

核酸和蛋白质这两种生物大分子之间的相互作用的研究是现代分子生物学、生物技术发展最快的领域之一。人们在研究核酸与蛋白质的相互作用中荧光分析的方法是一种较灵敏的方法。特别是利用荧光共振能量转移的原理设计的各类探针，对于研究DNA-蛋白质的相互作用,可达到mmol甚至更低的浓度。利用分子信标能实时研究DNA与蛋白质的结合,而且简单、灵敏、具有通用性(单链或双链DNA结合蛋白均可)。更为突出的是它可用于活体细胞的动态研究,这是其他方法无法比拟的。

3.分子信标用作生物芯片和生物传感器的探针

由于分子信标用于核酸、蛋白质的检测分析时具有许多优点,因而分子信标作为生物芯片、生物传感器中的ＤＮＡ探针可以充分利用这些优点。可以将标有不同荧光分子的分子信标通过生物素的形式固定到硅片的表面上,制成分子信标芯片。与其他类型探针的DNA芯片相比,分子信标芯片具有本底荧光低、无需除去多余的探针、可多次使用等优点。