师姐真传的一些引物设计技巧（师姐比师兄靠谱）

实验室小白遇上引物设计，一片迷茫，不知所措。

师姐：现在常用的的引物设计软件有Oligo、PrimerPremier、DNA man等等，还有在线引物设计软件。咱实验室的软件给你拿去。

（师姐比师兄靠谱，真的是手把手的教了，边操作边讲解。）

1.    在NCBI上搜索到该基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2.    PrimerPremier5.0安装上。

3.    打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。

4. 此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。

5. 点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

6. 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A结尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

7. 在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。

8. 当然，引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。

（1）选择blast中的nucleotide blast

（2）在choose search set中，database根据与操作基因的种属选择human，mouse或others。在program selection中选择somewhat similar sequences 项，点击blast按钮。

（3）等待几秒后，出现显示blast结果的网页。线段颜色与上面分值越高，特异性越好。（两条线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配，并与下游引物互补，理论上可以扩增基因片段。没有连线的表示单条引物与该基因一致。）

（4）点击线段跳转到该基因的结果信息概要：
（Accession：数据库系列的身份证，点击后可以获得该序列的信息
Dessecription：系列的简单描述。
Total score：高的就是两线段间有连线的
E value：被比对的两个序列不相关的可能性。E值越低越有意义。）

（5）一般能在结果找到你的目的基因的引物正确性都没问题。
（如果你找到一大批同物种的不同基因，而且分数也很高，说明引物设计的特异性不高，极易出现非特异性扩增。）

好了，今天就分享到这里，PCR相关实验做了几百遍，区区引物设计小case，觉得师姐的技巧实用的可以转发朋友圈或发给你的朋友哦，好东西要分享。想持续获得免费生物资讯，可以关注我的微信号，我们一起畅聊实验室里的那些事儿。

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