shRNA细胞系的筛选后发现，RNA水平没有变化，蛋白水平减少，是什么原因

在筛选 shRNA 细胞系后，如果你发现 RNA没有变化，但 蛋白水平减少，可能有多种原因。这里有一些可能的解释：

1. 转录后调控（Post-transcriptional regulation）

• miRNA或其他RNA调控：尽管shRNA能够靶向mRNA并降解其转录产物，细胞内可能存在 miRNA 或其他转录后调控机制（如RNA结合蛋白）影响 mRNA 的稳定性或翻译效率。这样，即使mRNA量没有显著下降，蛋白水平可能受到抑制。
• mRNA翻译抑制：shRNA通过干扰mRNA的稳定性或翻译过程，可能导致mRNA水平正常，但翻译后合成的蛋白质减少。例如，可能有 翻译抑制因子 与目标mRNA结合，从而阻止其翻译。

2. 蛋白降解途径

• 蛋白质降解：shRNA可以通过促使靶标蛋白的降解来减少蛋白质水平。即使mRNA水平没有变化，蛋白质可能通过 蛋白酶体 或 自噬途径 被降解。某些情况下，靶标蛋白在没有明显的mRNA变化时可能就被标记并降解。
• 蛋白稳定性改变：shRNA可能通过影响目标蛋白的折叠、修饰（如泛素化）或与其他细胞因子的相互作用，从而加速其降解。

3. 转录后剪接（Alternative splicing）

• 可变剪接：某些shRNA可能导致靶基因的可变剪接，生成一种不同的mRNA变体，这种变体可能会翻译成一个功能不同或不稳定的蛋白质，从而影响蛋白质水平。

4. RNA稳定性或转录起始受抑制

• mRNA稳定性问题：有些情况下，shRNA可能通过影响mRNA的 稳定性，使得RNA水平保持较为正常，但由于该mRNA不再高效合成蛋白或翻译受限，导致蛋白水平减少。
• 转录调控：shRNA有时会通过与转录因子相互作用间接影响转录过程，导致蛋白合成降低，即便mRNA水平并未显著下降。

5. 实验技术或方法的问题

• RT-qPCR或RNA检测技术问题：在某些情况下， RNA水平检测（如RT-qPCR）可能没有足够的灵敏度来检测小的变化，或者由于实验设计问题（如引物选择、文库构建等），无法准确反映目标mRNA的变化。
• 蛋白检测问题：在Western blot或其他蛋白分析方法中，可能出现某些技术问题，例如 抗体特异性、 蛋白量的检测阈值 不足，或者细胞提取蛋白的质量不佳，从而影响蛋白检测结果的准确性。

6. 细胞应激反应

• 细胞应激：shRNA可能导致目标基因的功能丧失或部分抑制，激发细胞的应激反应。细胞可能会通过改变代谢、蛋白合成或分解途径来适应这一变化，导致蛋白质合成的改变或增加其降解。

7. shRNA设计的特异性

• 靶向效率不足：如果shRNA设计不够特异，可能导致其对目标mRNA的结合并不完全或有效，从而没有显著地减少RNA水平。然而，shRNA可能通过其他机制仍能减少蛋白质表达（例如通过影响蛋白质的稳定性）。

总结和建议：

1. 检查转录后调控：探究目标蛋白是否受到翻译抑制或降解的影响。可以尝试检测mRNA的稳定性或进行翻译抑制实验（如使用 CHX 实验）。
2. 增强蛋白降解途径研究：使用蛋白降解抑制剂（如 MG132）测试蛋白质降解是否是减少的原因。
3. 验证实验方法：确保你的RNA和蛋白质检测方法没有技术问题（例如优化引物设计、抗体选择等）。
4. 使用其他指标：通过检测 mRNA半衰期 或者采用更灵敏的 RNA-seq 方法验证RNA水平变化。

总之，虽然shRNA会直接影响目标基因的转录产物，但蛋白水平的减少不一定完全由mRNA水平下降引起，转录后调控、蛋白降解、翻译抑制等多种机制都可能是原因。