我自己订的shRNA的质粒，不管是瞬转还是稳转，转录水平敲下来了百分之90了，但是蛋白水平就是不变😰。48小时、96小时、120小时我都收过，都是这样。我该怎么办呢？

根据描述，您的shRNA已经成功将转录水平（mRNA水平）敲低了90%，但蛋白水平却没有显著变化。这种情况在RNA干扰实验中并不罕见，可能由以下原因导致：

可能原因分析

1. 蛋白半衰期较长：
   • 有些蛋白具有较长的半衰期，即使mRNA水平显著下降，蛋白水平可能仍然稳定。这是因为已有的蛋白质分子不会立即降解，需要更长时间才能逐渐减少。
2. 翻译后调控：
   • 某些蛋白质可能受翻译后调控的影响，即便mRNA水平降低，细胞可能通过其他机制维持蛋白质的表达，例如通过提高翻译效率或减少降解。
3. 反馈机制：
   • 某些基因具有反馈机制，mRNA减少可能会引起其他途径的补偿，从而维持蛋白水平。
4. 实验检测灵敏度：
   • 观察不到蛋白水平的下降，可能也与检测方法的灵敏度有关。确保检测方法足够灵敏，能够检测到较小的蛋白表达变化。

建议的解决方案

1. 延长观察时间：
   • 可以进一步延长采样时间，例如至5天或更长，以观察是否蛋白水平逐渐下降。
2. 加速蛋白降解：
   • 考虑引入蛋白酶体抑制剂或其他药剂，辅助加速目标蛋白的降解，以更快地看到蛋白水平的变化。
3. 使用蛋白降解技术：
   • 可以考虑使用PROTACs（蛋白降解靶向嵌合体）或dTAG等技术，专门针对目标蛋白进行降解，以观察蛋白水平的变化。
4. 优化检测方法：
   • 使用更灵敏的蛋白检测方法（如Western blot的优化、ELISA或流式细胞术）来更准确地检测蛋白水平的细微变化。
5. 确认shRNA设计：
   • 如果条件允许，可以尝试使用不同的shRNA序列，确保现有的shRNA对目标蛋白的翻译确实有效果。

希望这些建议能帮助您找到解决方案，祝您的实验顺利！