双质粒共转染哺乳动物细胞，出现其中一个质粒表达量降低，而另一个质粒表达正常的情况，原因和解决办法

可能的原因：

1. 质粒竞争效应：
   • 在共转染过程中，两个质粒可能在转染效率、复制能力或表达资源（如转录因子和核糖体）上竞争。一个质粒可能因此受到抑制，导致其表达量下降。

   解决方法：

   • 提高低表达质粒的比例，例如2:1或更高。
   • 尝试使用等摩尔浓度（而非等质量浓度）的质粒来转染。
2. 质粒质量或纯度差异：
   • 低表达质粒可能存在降解、污染或纯化不完全的问题，从而影响其转染效率或表达水平。

   解决方法：

   • 检查质粒的完整性和浓度（如通过琼脂糖凝胶电泳）。
   • 确保使用高纯度质粒（OD260/280比值在1.8~2.0之间）。
3. 启动子强度差异：
   • 2个质粒可能使用不同的启动子，导致转录效率差异。
   • 如果其中一个的启动子更强（例如CMV启动子），可能会抑制另一个的表达。

   解决方法：

   • 确保两个质粒使用相同或兼容的启动子（例如都为CMV启动子）。
   • 更换为更强或更适合的启动子以提高低表达质粒的表达水平。
4. 转染效率不均：
   • 不同质粒可能具有不同的转染效率，导致表达水平差异。

   解决方法：

   • 优化转染条件，例如调整转染试剂用量、细胞密度或优化转染时间。
   • 测试不同的转染试剂（如脂质体、Entranster或电穿孔等）。
5. 质粒降解或沉默：
   • flag质粒可能更易受到细胞内降解或表观遗传沉默的影响。

   解决方法：

   • 检查质粒是否含有抗剪切或抗沉默的元件（如WPRE元件）。
   • 如果没有，重新设计载体，加入增强元件来防止沉默。
6. 实验误差：
   • 检测方法可能存在偏差。例如，qPCR或Western blot的技术误差可能导致表达量评估不准确。

   解决方法：

   • 重复实验，增加样本量。
   • 采用多种方法（如荧光检测、流式细胞仪）验证结果。

调试建议：

1. 优化转染比例：
   • 尝试不同的质粒混合比例（如1:1、2:1、3:1）并检测表达水平。
2. 对比单独转染的效果：
   • 单独转染，观察各自的表达水平。
   • 以此判断是否是共转染带来的竞争效应。
3. 验证转染效率：
   • 使用报告基因（如GFP）检测转染效率，确保整体转染效果。
4. 增加培养时间：
   • 如果转染后表达量随时间波动，可尝试延长表达时间（如48小时或72小时）以观察表达是否恢复。