免疫球蛋白G (IgG) 的纯化（一）

基本方案1 硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析

硫酸铵沉淀可纯化小鼠抗体的所有亚类和其他种属抗体，本方案也可用于纯化任何种属的lgM 、lgG 和lgA

材料

• 腹水或MAb 上清
• PBS
• 饱和硫酸铵(SAS)
• 硼酸盐缓冲液（可选）
• 聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-200 Superfine (Pharmacia Biotech)
• 含有0. 02% (m/V) NaN₃ 的PBS （可选）
• 玻璃棉(Glasswool, Polysciences)
• Sorvall 离心机， SS-34 型转子（或类似转子）
• 透析袋（无需按分子质量精确截断），保存于蒸馏水中
• 26mmX900mm 层析柱

流程

1a. 适用于腹水：为了清除腹水中的脂类物质， 可用足量玻璃棉盖住漏斗口，然后倒入腹水，再用PBS 充分冲洗玻璃棉，并戴好手套，轻轻挤压玻璃棉，收集全部样品（处理玻璃棉的时候请戴手套），将滤出液于4°C 或室溫下， 20000g 离心30min ，轻轻倒出上清并保存，弃去含膜和细胞碎片的沉淀。

1b. 适用于MAb 上清：将MAb 上清于4℃ 或室温下， 20000g 离心30min, 轻轻倒出上清并保存。

2. 边搅拌边慢慢向腹水或MAb 上清中加入SAS 至终浓度45% (V/V) ，静置1~2h 或4°C 静置过夜，保证使所有蛋白质沉淀。

3. 4°C 或室温下， 20000g 离心1h, 保留上清以检测抗体活性。用最小体积的PBS 或硼酸盐缓冲 (10~20ml) 溶解沉淀并转移到透析袋中。于4°C 在至少20 倍体积的PBS 或硼酸缓冲液中透析24~48h, 在透析过程中更换透析液4~6 次，最后将蛋白质浓缩至≤5ml。

4. 准备26mmX900mm 聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-200 Superfine 层析柱，将浓缩的蛋白质溶液上样 。用PBS, 或含0. 02% NaN₃ 的PBS 或硼酸缓冲液洗脱蛋白质，收集100 个组分（每个组分为1 ％柱体积，约4. 5ml) 。在280nm 波长检测蛋白质组分。

5. 用非还原型和还原型10 ％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 A₂₈₀>0.5 组分的蛋白质纯度。在非还原型凝胶上lgG 的条带在150kDa 左右，在还原型凝胶上，55kDa 左右的条带为lgG 重链， 25 kDa 左右的条带为lgG 的轻链。IgG2b 的重链呈非对称的糖基化，通常以二聚体形式存在。

6. 用分光光度计测定lgG A₂₈₀ 浓度 。将含纯 lgG 的洗脱液合并，用硼酸缓冲液或含0.02% NaN₃ 的PBS 调整IgG 浓度至0.1~30mg/ml, 可在4°C 保存数年。长期保存可以将lgG 置于- 70°C 保存，不要将抗体在- 20°C 储存超过一个月，要避免抗体的反复冻融。