免疫球蛋白G (IgG) 的纯化（二）

基本方案2  蛋白A交联琼脂糖凝胶亲和层析

蛋白A 通常用于人（除lgG₃外；小鼠lgG₁ 结合力也较弱）、兔、豚鼠和猪抗体的纯化。

材料

• 腹水或MAb 上清
• PBS, pH8.0 和pH 7.3
• 1mol/L NaOH
• 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B
• 0.1mol/L 柠檬酸， pH 按照所分离的抗体亚类的需要而定（步骤3)
• 10% (m/V) NaN₃ （可选）
• 硼酸盐缓冲液（可选）
• 3mol / L 过滤后的硫氰酸钾
• 玻璃棉 (Polysciences)
• 离心机，转子，4 ℃
• 0. 45μm 滤器，过滤MAb 上清
• 透析袋
• 1. 5cmX 10cm 层析柱（如铺有玻璃棉的10ml 注射器）
• 组分收集器
• 蠕动泵（可选）

流程

1a. 适用于腹水： 用玻璃棉去除腹水中脂类，用10 倍体积的PBS, pH 8.0 稀释腹水。

1b. 适用于MAb 上清： 于4℃ 将MAb 上清以 20000g 离心后用 0.45μm 滤器过滤。对于 lgG₁ 抗体，用透析（对pH8. 0 PBS) 或者加入1mol/L NaOH 的方法调整其pH到8.0 。对于其他抗体亚类则调整到pH7. 4.

2. 将蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 装入1. 5cmX 10cm 层析柱中， 连上组分收集器。于4℃ 或室温下用PBS , pH8. 0 平衡层析柱。上样(1ml 至几升）当上样量大时，可用蠕动泵或重力帮助上样。每亳升胶可结合约5mg 小鼠IgG 或 8mg 人IgG。用流式细胞仪或ELISA 检测流出的未结合组分中的抗体活性，以判断上样量是否过量。

3. 用数倍柱体积的PBS, pH8.0 洗柱，一直洗到 A₂₈₀ 到基线水平。用适当pH 的0.1mol/L 拧檬酸缓冲液（用1mol/L NaOH 调整）洗脱目的蛋白：小鼠 lgG₁ 用pH6. 5 、lgG₂ 用pH4. 5 、lgG₂ 和 lgG₃ 用pH3. 0 。
低 pH 会损伤抗体，因此洗脱前在收集管内按每毫升洗脱液加入50μl 2mol/L Tris-HCl缓冲液，用于立刻中和酸。

4. 合并含目的蛋白的组分，将合并组分倒入透析袋，用含或不含有0.02 % NaN₃的1L PBS (pH7.3) 透析，期间更换二次透析液，然后置于 4°C 保存。必要时可用SDS-PAGE 进行纯度鉴定。

5. 层析柱可以先用1 倍柱体积的过滤后的3mol/L 硫氰酸钾清洗，然后再用数个柱体积的PBS pH7. 3 洗柱， 最后保存于4°C 。