免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解（三）

基本方案3  胃蛋白酶水解IgG 成F（ab’）₂ 片段的摸索性试验

在此试验中摸索在两个不同pH 下IgG 的水解情况，因为IgG 在低pH 下会水解成Fab 片段或更小的片段。胃蛋白酶的水解比木瓜蛋白酶更剧烈，因此推荐的酶／抗体 (E/A) 比例以不超过1: 20 为佳。

注意：从IgG_2b水解不能得到F (ab’)₂ 片段，用胃蛋白酶水解IgG_2b，会得到相同分子质量的片段(120kDa) ，但这些是Fab/c片段（含一个Fab 片段和完整的Fe 部分）。

材料

• 3mg/ml 纯化的IgG
• pH4. 0 和pH5. 0 乙酸缓冲液：0.2 mol/L 乙酸钠，用冰醋酸调至所需pH
• 0. 1mg/ml 胃蛋白酶 ：溶于pH4. 0 乙酸缓冲液
• 0.1mg/ml 胃蛋白酶 ：溶于pH4. 5 乙酸缓冲液
• 2mol/L Tris 碱
• PBS

流程

1. 将2ml 3mg/ml 纯化的lgG 分别对着200ml 乙酸缓冲液(pH 分别为4.0 和4. 5) 透析， 4°C 透析4h 。
2. 用对应pH 的乙酸缓冲液作为空白对照测 A₂₈₀ 值，确定两种透析后lgG 的浓度 ，用对应pH 的乙酸缓冲液将两种lgG 水解液的浓度调至2mg/ml 。
3. 将100μl 2mg/ml lgG pH4. 0 加入16 个标号的微量离心管中，将100μl 2mg/ml IgG pH4. 5 加入另外16 个标号的微量离心管中。
4. 将100μl 0.1mg/ml 胃蛋白酶液pH4. 0 加入8 个lgG pH4.0离心管中，将100μl 乙酸缓冲液pH4. 0 加入另外8 个IgG pH4. 0 离心管中。将100μl 0.1mg/ml 胃蛋白酶液pH4. 5 加入8 个lgG pH4. 5 离心管中，将100μl 乙酸缓冲液pH4. 5 加人另外8 个IgG pH4.5 离心管中［在两种不同pH 溶液中酶／抗体(E/A) 比例为1 : 20] 。
5. 将所有离心管置于37°C 水浴，分别在1h 、2h 、4h、6h 、12h、24h 和48h 时从四组各8 个离心管中取出1 个离心管，在取出的离心管中加入40μl 2mol/L Tris 碱终止酶解反应。
6. 将水解液转至透析袋中，并准备微量透析槽，在4℃ 下对着1LPBS 透析4h。
7. 用10 ％非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，每管上样量为80μl, F（ab’）₂  片段分子大小为110kDa , 较小分子质量（约50kDa) 的条带可能是Fab’ 片段。从中确定获取最大量F（ab’）₂ 片段的最佳条件，用于基本方案4 中。